Summary
Um protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interesse para a saúde humana), utilizando um método de triagem recém-desenvolvido com base em um método imunoquímico competitiva e uma detecção eletroquímica final é demonstrada.
Abstract
Imunoensaios são uma alternativa válida para o mais caro e demorado quantitativa HPLC ou GC 1, 2 métodos para a detecção de triagem de micotoxinas perigosas em commodities de alimentos. Neste protocolo, mostramos como fabricar e interrogar uma enzima eletroquímica competitivas ligadas imunomagnética ensaio baseado no uso de esferas magnéticas como suporte sólido para a cadeia imunoquímicos 3 e eletrodos serigrafados como sensoriamento plataforma.
Nosso método visa determinar a quantidade total de HT-2 e T-2 toxinas, as micotoxinas, pertencente à família tricotecenos e de grande preocupação para a saúde humana 4. A utilização de um clone de anticorpo com uma reatividade cruzada de 100% para HT-2 e T-2 permite detectar simultaneamente tanto toxinas com sensibilidade similar 5.
O primeiro passo do nosso teste é a etapa de revestimento em que imobilizar HT2-KLH toxina conjugada na superfície das esferas magnéticas. Depois de uma etapa de bloqueio, necessário para evitar a não-específica absorções, a adição de um anticorpo monoclonal permite a competição entre imobilizada HT-2 e do presente livre HT-2 ou T-2 na amostra ou dissolvido em uma solução padrão.
No final da etapa de competição, a quantidade de anticorpo monoclonal ligado ao imobilizado HT-2 será inversamente proporcional à quantidade de toxina na solução da amostra.
Um anticorpo secundário marcado com fosfatase alcalina (AP) é usado para revelar a ligação entre o anticorpo específico ea imobilizada HT-2. A etapa de medição final é realizada por deixar cair uma alíquota de suspensão grânulo magnético, correspondente a uma determinada amostra de solução / standard, na superfície de um eletrodo serigrafado de trabalho; esferas magnéticas são imobilizados e concentrada por meio de um ímã colocado exatamente sob o serigrafado eletrodo. Após dois minutos de incubação entre as esferas magnéticas e um substrato para a AP, o produto enzimático é detectado por voltametria de pulso diferencial (DPV), utilizando um instrumento portátil (PalmSens) também capaz de iniciar automaticamente oito medidas dentro de um intervalo de poucos segundos.
Protocol
1) Bloqueio de esferas magnéticas revestidas:
Proceder como a seguir para bloquear Revestido esferas magnéticas:
- Preparar um conjunto de 2 tubos Eppendorf ml;
- Homogeneizar (balançando, mas não vórtice) revestido esferas magnéticas (veja o apêndice para a preparação de esferas magnéticas revestidas) utilizando a amostra rotativa misturador;
- Imediatamente após a homogeneização, pipetar 10 ml de esferas magnéticas revestidas em cada tubos separados Eppendorf;
- Adicionar 1 ml de leite desnatado solução de bloqueio em cada tubo Eppendorf do conjunto;
- Deixe esferas magnéticas incubar por 30 min em temperatura ambiente no mixer amostra rotativa;
- Remover solução de bloqueio: para fazê-lo colocar o tubo no concentrador de partículas magnéticas com a parte magnética colocar por 2 min (ver esferas magnéticas que adere na parede lateral do tubo); cuidadosamente pipeta fora o sobrenadante, deixando contas inalteradas;
- Adicionar 1 ml de tampão PBS + NaN 3 + BSA como solução de armazenamento para cada tubo;
- Loja revestido e bloqueou esferas magnéticas a 4 ° C (note que revestido esferas magnéticas são estáveis por pelo menos 2 meses a 4 ° C);
2) cadeia imunológica em esferas magnéticas para a construção da curva de calibração e análise de amostras
Proceder como a seguir a ter esferas magnéticas pronto para a medição:
- Pegue um tubo de Eppendorf (2 ml) de solução revestido e bloqueado para cada extracto de amostra que você vai analisar;
- Pegue um tubo Eppendorf extra para cada solução de calibração de trabalho;
- Homogeneizar as esferas magnéticas por 2 min no mixer amostra girando antes de usar;
- Remover o líquido de armazenamento usando concentrador de partículas magnéticas;
- Lavar as esferas magnéticas três vezes com PBS / BSA a solução de lavagem. Retirar a roupa líquido;
- Passo competição: Adicionar para cada tubo contendo as contas lavados magnético, extrato de 200μl da amostra preparada, uso um tubo magnético talão para cada amostra. Repita o mesmo procedimento para cada solução padrão. Adicione 200 ml de solução de anticorpo monoclonal para cada tubo magnético talão. Deixe esferas magnéticas incubar por meia hora no misturador de rotação da amostra em temperatura ambiente;
- Remover a partir de tubos Eppendorf a solução utilizada para a competição passo;
- Rotulagem passo: Adicionar 400μl de anticorpo marcado secundária a cada magnética tubo Eppendorf talão. Deixe esferas magnéticas incubar por meia hora no misturador de rotação da amostra em temperatura ambiente;
- Remover rotulagem solução de tubos Eppendorf;
- Lavar as esferas magnéticas três vezes com PBS / Tween ® 20 solução de lavagem. Remover o líquido;
- Ressuspender com 100μl de tampão DEA cada alíquota de esferas magnéticas. Agora, a esferas magnéticas estão prontos para a etapa de medição eletroquímica;
3) Assembléia de PalmSens ao Multiplexer (Mux) opções
Por favor note: produto de hidrólise enzimática do substrato faltas a superfície do eletrodo, por esta razão um novo eletrodo é necessário para cada medição.
- Conectar um laptop PC para PalmSens através do cabo serial;
- Ligue a ficha 9-DIN de CH8 Multiplexer com PalmSens.
- Conecte o cabo de série dos Oito canal de contato elétrico com Mux CH8 Multiplexer;
- Colocar a tira de eletrodo no bloco ímã oito. Preste atenção para colocar cada um ímã em cada eletrodos de trabalho (de nota, a necessidade de um ímã único para cada eletrodo é imperativo caso contrário, a partícula magnética não será concentrado na área do eletrodo de trabalho);
- Conecte os eletrodos strip em oito canal de contato Mux elétrica;
Para a medição DPV usar os seguintes parâmetros nas caixas apropriadas:
E começar: 0 (V); fim E: 0,6 (V); passo E: 0,016 (V); E pulso: 0,0339 (V); E condicionado: 0 (V); deposição E: 0 (V); Taxa de leitura : 0,1 (V / s); T pulso: 0,06 (s); condicionado T: 0 (s); T deposição: 0 (s); equilíbrio T: 8 (s).
4) reação enzimática e Eletroquímica Medição
- Homogeneizar agitando cada tubo Eppendorf contendo esferas magnéticas pronto para etapa de medição eletroquímica, a fim de obter uma suspensão bem dispersa de esferas magnéticas;
- Pipeta de cada Eppendorf, imediatamente após a homogeneização, uma alíquota de 20 mL da dispersão magnética talão para a superfície do eletrodo de trabalho correspondente. Para cada eletrodo de uma tira de usar 20 l de esferas magnéticas tomadas a partir de tubos Eppendorf diferentes (por exemplo, por oito use eletrodo oito Eppendorf diferentes);
- Adicionar 80 ml de solução substrato enzimático no primeiro eletrodo. Iniciar 2 min contagem regressiva. Após 14 segundos, adicione 80 ml de solução substrato enzimático sobre o segundo eletrodo. Após mais 14 segundos, adicione 80 ml de solução substrato enzimático sobre o terceiro eletrodo. Proceder ao int mesmo tempoErval (14 segundos) até o último eletrodo (que significa: queda cada alíquota de substrato com intervalos de 14 seg). O tempo de intervalo de 14 segundos é calculado como o tempo exigido pelo potenciostato para executar a medição; de nota, a solução 80 mL em cada sensor deve cobrir o eletrodo de referência de trabalho, e contador. Além disso, as soluções para cada sensor não deve entrar em contato com soluções de eletrodos vizinhos.
- Após a 2 min contagem decrescente a partir da primeira adição da solução do substrato enzimático, inicie a medição eletroquímica;
- Use o PalmSens Lite software para obter picos de corrente (mA) para cada solução.
5 Cálculo)
Estabelecer uma curva de calibração usando uma equação logística quatro parâmetros e calcular a concentração da quantidade total de toxina HT-2/T-2 em nanogramas por mililitro de cada tubo Eppendorf contendo amostra desconhecida.
Os dados experimentais, a altura máxima (mA) contra a concentração dos calibradores (ng / ml), têm de estar equipados com um não-linear logístico quatro parâmetros-(4-PL) enredo equação (1) (usando Sigma Plot 8.0 ou Kaleidagraph). O modelo de 4-PL não-linear é usualmente adotado para descrever ligante ensaios de ligação (LBAs) 6.
(1)
a, b, x0, y0 são parâmetros logística como dado pelo programa Sigma Plot caber curva.
Use a fórmula explicada para calcular o teor de HT-2/T-2 montante total de toxina na solução de amostra diluída extrair 
(2)
x é a concentração em massa da quantidade total de HT-2/T-2 toxinas na solução extrato diluído, calculado a partir da equação 4 parâmetros logística em nanograma por milliltre (ng / ml)
y é o valor atual em mA obtidos para a amostra desconhecida
Apêndice
6) revestido esferas magnéticas
Proceder como a seguir a ter revestido esferas magnéticas:
Procedimento de lavagem
- Homogeneizar Dynabeads tosylactivated ® M-280 (solução 2 x 109 grânulos / ml) por agitação e vórtex (velocidade máxima) por 1 min (para evitar a formação de espuma) (observe a concentração de esferas magnéticas deve ser sempre o mesmo para garantir reprodutibilidade em a medição);
- Imediatamente pipetar 1 ml das esferas acima homogeneizada em um tubo Eppendorf 2 ml;
- Colocar o tubo no concentrador de partículas magnéticas com a parte magnética colocar por 2 min (ver esferas magnéticas furar na parede lateral do tubo);
- Cuidadosamente pipeta fora do sobrenadante, deixando contas inalteradas;
- Retire o tubo Eppendorf do concentrador de partículas magnéticas e ressuspender as contas em 1 ml de 0,1 M de borato pH 9,5. Misture delicadamente por 2 minutos no liquidificador amostra rotativa por 2 min;
- Pipeta fora do sobrenadante;
- Pipetar 1 ml de solução tampão borato no tubo Eppendorf. Esferas magnéticas está agora pronto para a etapa de revestimento;
Procedimento de revestimento
- Adicione 600 ml de HT-2 conjugado com KLH solução-mãe (Keyhole Limpet Hemocianina) a 1 ml de esferas magnéticas) (final de concentração HT-2-KLH de 375 mg / ml); incubar esferas magnéticas e HT-2-KLH solução para 20h a 37 ° C * com rotação lenta em tilt giratório misturador amostra;
- Depois de colocar o tubo de incubação no concentrador de partículas magnéticas e pipetar fora do sobrenadante;
Lavar contas revestido duas vezes com 1 ml de PBS / BSA solução tampão. Entre cada lavagem remover PBS / BSA solução. Todos etapa de lavagem foram realizados configuração esferas magnéticas e PBS / BSA em rotação misturador por 5 min; - Lavar as esferas magnéticas, uma vez com 1 ml de TRIS / BSA solução tampão. Remover TRIS / solução BSA. Realizar esta etapa definindo esferas magnéticas e TRIS / BSA em tampão rotação misturador para 4 h a 37 ° C *;
- Lavar as esferas magnéticas, uma vez usando 1ml de atualizado (mantido na geladeira a 4 ° C) PBS / BSA solução tampão. Remover PBS / BSA solução. Realizar esta etapa configuração esferas magnéticas e PBS / BSA em tampão rotação misturador para 5min à temperatura ambiente;
- Após a lavagem passo remover todo o líquido de lavagem e adicionar 1 ml tampão PBS + NaN 3 + BSA como líquido de armazenamento;
- Loja esferas magnéticas revestidas a 4 ° C (note que revestido esferas magnéticas são estáveis por pelo menos 2 meses a 4 ° C);
* Para este efeito, o mixer é colocado no forno equipado com um buraco que permite a inserção do cabo para o fornecimento de energia. Alternativamente, o misturador pode ser colocado em uma sala termostatizado a 37 ° C.
7) A preparação das amostras e extração
25 g de amostra finamente moída (cereais bebê comida ou café da manhã) estamosighed em um copo do liquidificador e extraídas com 100 ml de acetonitrila / solução de água (86/14) por 3 min em um misturador de alta velocidade. Após centrifugação a 4000 rpm (3000 g) por 5 min, 8 ml do sobrenadante foram tomadas e purificados com coluna Mycosep, 4 ml do extrato limpas foram secas sob fluxo de nitrogênio. Amostras secas podem ser armazenadas a -30 ° C até vários meses.
8) a reconstituição da amostra
Cereais de pequeno almoço
Reconstituir o extrato de cereais secos pequeno-almoço (comida à base de cereais destinados ao consumo adulto) com 40 ml de PBS pH 7,4. Desta forma uma amostra com uma concentração de toxina igual ao limite legal suposto (200 ng / g) dará na etapa de medição um sinal de queda no meio da faixa de trabalho.
Alimentos para bebês
Reconstituir o extrato de alimentos secos baby (alimentos à base de cereais destinados ao consumo infantil) com 4 ml de PBS. Desta forma uma amostra com uma concentração de toxinas igual ao limite legal suposto (20-25 ng / g) dará na etapa de medição um sinal de queda no meio da faixa de trabalho.
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Discussion
O uso de anticorpos como sonda de reconhecimento biomolecular viu um uso generalizado de tecnologias de sensoriamento; metodologias de detecção imunoquímica, como os testes ELISA e Meias, são, hoje em dia, entre as plataformas mais utilizadas e aplicadas em muitos laboratórios 7.
Embora essas abordagens alcançar a sensibilidade excepcional e especificidade, o objetivo principal dos muitos grupos de pesquisa nos últimos anos tem sido a melhoria e otimização de suas performances.
Neste protocolo temos mostrado como fabricar e interrogar uma imunossensor eletroquímico para detecção de micotoxinas. Acreditamos que o uso da eletroquímica para desenvolver imuno-sensores baseados irá revelar-se de importância crescente no futuro. Isto é devido às vantagens inerentes à detecção eletroquímica sobre a óptica. Eletroquímica é, de fato menos propenso a interferências e provou notavelmente robusto contra a adsorção não-específica e um bom desempenho, mesmo quando desafiados em matrizes de amostras complexas, tais como cereais matinais e alimentos para bebés. Além disso, eletroquímica é mais adequado para a miniaturização e para array multi-adaptação.
O acoplamento dessa abordagem com nanopartículas magnéticas também melhoraram o desempenho analítico e provaram ser particularmente apropriado para detecção de contaminantes em amostras de alimentos.
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Acknowledgments
Autores gostariam de agradecer a Nancy Downer e todos os membros do laboratório de Química Analítica, Universidade de Roma "Tor Vergata" por sua colaboração e apoio logístico. Este trabalho foi financiado pelo projecto da União Europeia "BioCop".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DEA (99.5%) | Sigma-Aldrich | 31589 | |
| HCl 37% | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| H3BO3 | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Tris[hydroxymethyl]-aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| BSA (albumin bovine serum) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| NaN3 | Aldrich | 71290 | |
| 1-Naphthyl phosphate disodium salt | Fluka | N7255 | |
| Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS): | Biopure | 004050 | The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage. |
| Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml. | Vector Laboratories | AP-2000 | |
| HT-2 toxin | Biopure | ||
| Magnetic beads: Dynabeads® | Invitrogen | M-280 Tosylactivated | Concentration 2 x 109 beads/ml. |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water | ||
| Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 | Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water. | ||
| Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5 | Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water. | ||
| TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5 | Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water. | ||
| TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4 | Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use. | ||
| PBS buffer + TWEEN® 0.05% | Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4 | ||
| PBS buffer + BSA solution 0.1% | Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use. | ||
| PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02% | Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution | ||
| Enzymatic substrate | Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use. | ||
| Skimmed milk blocking solution | Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use. | ||
| HT-2 stock solution | Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C. | ||
| HT-2 Working standard solution | Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use. | ||
| HT-2 Working calibrant solutions | Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use. | ||
| HT-2 conjugated with KLH | Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C. | ||
| Specific Monoclonal Antibody | Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples. | ||
| Secondary Labeled Antibody | Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use. | ||
| Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S | Invitrogen | ||
| PalmSens instrument | PalmSens | Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software | |
| CH8 PalmSens Multiplexer | PalmSens | ||
| Eight channel Mux electric contact | hand made | ||
| Strip with eight screen printed electrodes (SPEs) | hand made | ||
| Specially designed support for electrodes strip | hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE | ||
| Calibrated microliter pipettes | Gilson, Inc. | ||
| Magnetic stirrer and stir bars. | |||
| Glass beakers (100, 50, 20 ml). | |||
| Volumetric flasks (2ml). | |||
| 0.2 and 2ml Eppendorf tubes. | Eppendorf | ||
| Falcon tubes of 5ml and 15ml. | Falcon BD | ||
| Laboratory Vortex Mixer | Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts | ||
| Laboratory oven or thermostated room | Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C. |
References
- Koch, P.
- Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals. Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).
- Morozova, T. Y., Morozov, V. N. Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads. Anal. Biochem. , 263-271 (2008).
- FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, , Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).
- Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study. Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis. Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).
