ELIME (Enzyme Linked Inmuno magnética químicos) Método para la detección de micotoxinas

Summary

Un protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interés para la salud humana), utilizando un método de selección de nuevo desarrollo basado en un método competitivo inmunoquímica y un final de la detección electroquímica se demuestra.

Abstract

Inmunoensayos son una alternativa válida a la que consumen más caro y HPLC cuantitativa o GC ^{1, 2} métodos de cribado para la detección de micotoxinas peligrosas en los productos alimenticios. En este protocolo se muestra cómo fabricar e interrogar a una enzima vinculada ensayo electroquímicos competitivos inmunomagnética basado en el uso de partículas magnéticas como soporte sólido para la cadena de inmunoquímica ³ y electrodos serigrafiados como la detección de la plataforma.

Nuestro método tiene como objetivo determinar la cantidad total de HT-2 y las toxinas T-2, las micotoxinas que pertenecen a la familia de los tricotecenos y de gran preocupación para la salud humana ^4. El uso de un anticuerpo clon con una reactividad cruzada del 100% para HT-2 y T-2 permite detectar simultáneamente dos toxinas con una sensibilidad similar ^5.

El primer paso de nuestro análisis es la etapa de recubrimiento en el que inmovilizar HT2-KLH conjugado toxina en la superficie de partículas magnéticas. Después de una etapa de bloqueo, necesario para evitar absorciones no específicas, la adición de un anticuerpo monoclonal permite la competencia entre los inmovilizados HT-2 y libres presentes HT-2 o T-2 en la muestra o en una solución estándar.

Al final de la etapa de la competencia, la cantidad de anticuerpo monoclonal ligado a la inmovilización HT-2 será inversamente proporcional a la cantidad de toxina en la solución de la muestra.

Un anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina (AP) se utiliza para mostrar la unión entre el anticuerpo específico y el inmovilizado HT-2. La etapa de medición final se realiza dejando caer una parte alícuota de la suspensión de cuentas magnéticas, correspondientes a una muestra específica / solución estándar, en la superficie de un electrodo serigrafiado de trabajo, partículas magnéticas se inmovilizan y se concentraron por medio de un imán colocado precisamente bajo el serigrafiado de los electrodos. Después de dos minutos de incubación entre partículas magnéticas y un sustrato de la AP, el producto enzimático es detectado por voltametría de pulso diferencial (DPV), utilizando un equipo portátil (PalmSens) también es capaz de iniciar automáticamente ocho mediciones en un intervalo de pocos segundos.

Protocol

1) El bloqueo de perlas magnéticas recubiertas con:

Proceder de la siguiente manera para bloquear perlas magnéticas recubiertas con:

1. Preparar un conjunto de 2 ml tubos Eppendorf;
2. Homogeneizar (temblores, pero no agitación) de perlas magnéticas recubiertas (véase el apéndice para la preparación de perlas magnéticas recubiertas) con la muestra de rotación del mezclador;
3. Inmediatamente después de la homogeneización, pipeta de 10 l de perlas magnéticas recubiertas por separado en cada uno de los tubos Eppendorf;
4. Añadir 1 ml de leche desnatada solución de bloqueo en cada tubo Eppendorf de la serie;
5. Vamos a perlas magnéticas se incuba durante 30 min a temperatura ambiente en el mezclador de rotación de la muestra;
6. Retire la solución de bloqueo: para ello se coloca el tubo en el concentrador de partículas magnéticas con la parte magnética para poner en 2 minutos (ver partículas magnéticas se pegue en la pared lateral del tubo); pipeta cuidadosamente el sobrenadante, dejando cuentas sin perturbaciones;
7. Añadir 1 ml de tampón PBS + _NaN3 + BSA como solución de almacenamiento para cada tubo;
8. Tienda recubierto y bloquearon las bolas magnéticas a 4 ° C (por favor, tenga en cuenta que de perlas magnéticas recubiertas son estables durante al menos 2 meses a 4 ° C);

2) la cadena inmunológica en partículas magnéticas para la construcción de la curva de calibración y análisis de las muestras

Proceder de la siguiente manera para que las bolas magnéticas listo para la medición:

1. Tome un tubo de Eppendorf (2 ml) de solución de cubierta y bloqueada por cada extracto de muestra que se va a analizar;
2. Tomar un extra de tubo de Eppendorf para cada solución calibrador de trabajo;
3. Homogeneizar las bolas magnéticas durante 2 minutos en el mezclador de rotación de la muestra antes de su uso;
4. Retire el líquido de almacenamiento mediante concentrador de partículas magnéticas;
5. Lávese las partículas magnéticas tres veces con solución de lavado PBS / BSA. Eliminar líquido de lavado;
6. Paso la competencia: Añadir a cada tubo que contiene las cuentas de lavado magnético, 200μl de la muestra de extracto preparado, el uso de un tubo de cuentas magnéticas para cada muestra. Repita el mismo procedimiento para cada solución estándar. Añadir 200 l de solución de anticuerpos monoclonales para cada tubo de cuentas magnéticas. Vamos a perlas magnéticas se incuba durante una media hora en el mezclador de rotación de la muestra a temperatura ambiente;
7. Eliminar de los tubos Eppendorf la solución utilizada para la competición a paso;
8. Etiquetado paso: Añadir 400μl del anticuerpo secundario marcado a cada tubo de bolas magnéticas Eppendorf. Vamos a perlas magnéticas se incuba durante una media hora en el mezclador de rotación de la muestra a temperatura ambiente;
9. Quitar el etiquetado de los tubos Eppendorf solución;
10. Lávese las partículas magnéticas tres veces con PBS / Tween ® 20 solución de lavado. Eliminar el líquido;
11. Resuspender con 100μl de buffer DEA cada alícuota de partículas magnéticas. Ahora las bolas magnéticas están listos para la etapa de medición electroquímica;

3) El conjunto de PalmSens con el multiplexor (MUX) opciones

Tenga en cuenta: el producto enzimático de hidrólisis del sustrato faltas la superficie del electrodo, por este motivo un nuevo electrodo que se necesita para cada medición.

1. Conectar un PC portátil a PalmSens a través del cable de serie;
2. Conecte el conector de 9-DIN de CH8 multiplexor con PalmSens.
3. Conecte el cable de serie de ocho canales Mux contacto eléctrico con CH8 multiplexor;
4. Coloque la tira de electrodos en el bloque de imán ocho. Preste atención para que cada imán debajo de cada electrodo de trabajo (de la nota, la necesidad de un solo imán para cada electrodo es imprescindible lo contrario, la partícula magnética no se concentrará en el área del electrodo de trabajo);
5. Conecte la tira de electrodos en ocho canales de contacto eléctrico Mux;

Para la medición de la DPV utilizar los siguientes parámetros en las casillas correspondientes:
E comenzar: 0 (V); final E: 0,6 (V); paso E: 0.016 (V); E pulso: 0,0339 (V); E acondicionado: 0 (V), deposición de E: 0 (V); Velocidad de lectura : 0,1 (V / s); T pulso: 0,06 (s); acondicionado T: 0 (s), deposición de T: 0 (s) de equilibrio T: 8 (s).

4) una reacción enzimática y medición electroquímica

1. Homogeneizar agitando suavemente cada tubo Eppendorf que contiene partículas magnéticas listo para la etapa de medición electroquímica con el fin de obtener una suspensión y dispersión de partículas magnéticas;
2. Pipeta de cada Eppendorf, inmediatamente después de la homogeneización, una alícuota de 20 l de la dispersión con bolas magnéticas en la superficie del electrodo de trabajo correspondiente. Para cada electrodo del uso de una franja de 20 l de bolas magnéticas tomadas de diferentes tubos Eppendorf (por ejemplo, para el uso de electrodos ocho ocho diferentes Eppendorf);
3. Añadir 80 l de solución de sustrato enzimático en el primer electrodo. Inicio 2 minutos la cuenta regresiva. Después de 14 segundos, añadir 80 l de solución de sustrato enzimático en el segundo electrodo. Después de otros 14 segundos, añadir 80 l de solución de sustrato enzimático en el thiº de los electrodos. Proceder, en el mismo intervalo de tiempo (14 segundos) hasta que el último electrodo (que significa: agacharse cada alícuota de sustrato, con intervalos de 14 segundos). El intervalo de tiempo de 14 segundos se calcula como el tiempo requerido por el potenciostato para realizar la medición de la nota, la solución de 80 l de cada sensor debe cubrir el electrodo de trabajo, referencia y contra. Además, las soluciones para cada sensor no debe entrar en contacto con las soluciones de los electrodos de vecinos.
4. Después del minuto 2 la cuenta regresiva de la primera adición de la solución de sustrato enzimático, iniciar la medición electroquímica;
5. Utilice el PalmSens Lite para obtener picos de corriente (mA) para cada solución.

5) Cálculo

Establecer una curva de calibración utilizando una ecuación logística cuatro parámetros para calcular la concentración de la cantidad total de toxina HT-2/T-2 en nanogramos por mililitro para cada tubo Eppendorf que contiene la muestra desconocida.

Los datos experimentales, la altura del pico (mA) en contra de la concentración de los calibradores (ng / ml), debe estar equipado con un no-lineal de cuatro parámetros logísticos (4-PL) trama ecuación (1) (con Sigma Plot 8.0 o KaleidaGraph). La no-lineal 4-PL modelo se adopta generalmente para describir los ensayos de unión ligando (LBA) ^6.

(1)
a, b, x0, y0 son los parámetros de logística dada por el programa Sigma Plot ajuste de la curva.
Use la fórmula explicada para calcular el contenido de HT-2/T-2 cantidad total de toxina en la solución de extracto de la muestra diluida
(2)
x es la concentración en masa de la cantidad total de HT-2/T-2 toxinas en la solución del extracto diluido, calculado a partir de la ecuación logística cuatro parámetros en nanogramos por milliltre (ng / ml)
y es el valor actual en mA obtenidos para la muestra desconocida

Apéndice

6) de perlas magnéticas recubiertas

Proceder de la siguiente manera para tener perlas magnéticas recubiertas con:

1. Procedimiento de lavado

1. Homogeneizar tosylactivated Dynabeads ® M-280 (solución madre 2 x 109 cuentas / ml) por agitación y agitación (velocidad máxima) durante 1 min (evitar la formación de espuma) (tenga en cuenta la concentración de partículas magnéticas debe ser siempre la misma para asegurar la reproducibilidad de la medición);
2. Inmediatamente pipeta de 1 ml de homogeneizado por encima de las cuentas en un tubo de 2 ml Eppendorf;
3. Colocar el tubo en el concentrador de partículas magnéticas con la parte magnética para poner en 2 minutos (ver partículas magnéticas se pegue en la pared lateral del tubo);
4. Pipeta cuidadosamente el sobrenadante, dejando inalteradas cuentas;
5. Retire el tubo de Eppendorf del concentrador de partículas magnéticas y volver a suspender las bolas en 1 ml de 0,1 M pH 9,5 borato. Mezclar suavemente durante 2 minutos en el mezclador de rotación de la muestra durante 2 minutos;
6. Pipeta el sobrenadante;
7. Pipeta de 1 ml de solución tampón de borato en el tubo Eppendorf. Partículas magnéticas están listos para el paso de revestimiento;

   Proceso de emulsionado

8. Añadir 600 ml de HT-2 conjugado con KLH solución stock (hemocianina de lapa californiana) a 1 ml de partículas magnéticas) (final HT-2-KLH concentración de 375 mg / ml); incubar perlas magnéticas y la solución HT-2-KLH para 20h a 37 ° C * con una rotación lenta de inclinación en la rotación de mezclador de la muestra;
9. Después de colocar el tubo de incubación en el concentrador de partículas magnéticas y la pipeta el sobrenadante;
   Lávese las bolas recubiertas dos veces con 1 ml de solución tampón PBS / BSA. Entre cada lavado eliminar PBS / BSA solución. Todos los pasos de lavado se realizaron entorno perlas magnéticas y PBS / BSA en un mezclador rotatorio durante 5 minutos;
10. Lávese las bolas magnéticas, una vez utilizando 1 ml de solución tampón TRIS / BSA. Quitar TRIS / solución de BSA. Llevar a cabo este paso mediante el establecimiento de perlas magnéticas y tampón Tris / BSA en la rotación de mezclador de 4 horas a 37 ° C *;
11. Lávese las bolas magnéticas con 1 ml de una vez refrescado (conservarse en la nevera a 4 ° C) de PBS / BSA solución buffer. Quitar PBS / BSA solución. Llevar a cabo este paso, establecer las bolas magnéticas y el tampón PBS / BSA en la rotación de mezclador durante 5 minutos a temperatura ambiente;
12. Después de la etapa de lavado eliminar todo el líquido de lavado y añadir 1 ml de tampón PBS + _NaN3 + BSA como de almacenamiento de líquidos;
13. Tienda de perlas magnéticas recubiertas a 4 ° C (por favor, tenga en cuenta que de perlas magnéticas recubiertas son estables durante al menos 2 meses a 4 ° C);

    * Para este fin, el mezclador se coloca en el horno equipado con un agujero que permite la inserción de los cables de la fuente de alimentación. Como alternativa, el mezclador puede ser colocado en una habitación con termostato a 37 ° C.

7) Preparación de la muestra y la extracción

25 g demuestra finamente molida (el bebé los cereales del desayuno o la comida) se pesan en un vaso de la licuadora y se extrajo con 100 ml de solución de acetonitrilo / agua (86/14) durante 3 minutos en una batidora de alta velocidad. Después de la centrifugación a 4000 rpm (3000 g) durante 5 minutos, 8 ml de sobrenadante se tomaron y se purifica con la columna Mycosep, 4 ml de extracto de limpieza se secaron bajo corriente de nitrógeno. Las muestras secas se pueden guardar a -30 ° C hasta varios meses.

8) la reconstitución de muestra

Cereales para el desayuno

Reconstituir el extracto seco de cereales de desayuno (comida a base de cereales destinados al consumo para adultos) con 40 ml de PBS pH 7,4. De esta manera, una muestra con una concentración de la toxina igual que el límite legal supone (200 ng / g) se dan en la etapa de medición de una señal cae en el medio del rango de trabajo.

Comida para bebés

Reconstituir el bebé extracto seco de alimentos (comida a base de cereales destinados al consumo infantil) con 4 ml de PBS. De esta manera, una muestra con una concentración de toxinas igual que el límite legal supone (20-25 ng / g) se dan en la etapa de medición de una señal cae en el medio del rango de trabajo.

Discussion

El uso de anticuerpos como la sonda de reconocimiento biomolecular ha visto un uso generalizado de tecnologías de detección, métodos inmunoquímicos de detección, tales como ELISA y Meias, son, hoy en día, entre las plataformas más utilizadas y aplicadas en muchos laboratorios de ^7.

Si bien estos enfoques lograr una sensibilidad y especificidad, el objetivo principal de muchos grupos de investigación en los últimos años ha sido la mejora y optimización de sus actuaciones.

En este protocolo se ha mostrado cómo fabricar e interrogar a un inmunosensor electroquímico para la detección de micotoxinas. Creemos que el uso de la electroquímica para desarrollar sensores basados ​​en inmuno-resultará ser cada vez más importancia en el futuro. Esto se debe a las ventajas inherentes de la detección electroquímica en la óptica de una. Electroquímica es, de hecho, menos propenso a interferencias y ha demostrado ser especialmente robusto frente a la adsorción no específica y un buen rendimiento incluso cuando son desafiados en matrices de muestras complejas, tales como cereales para el desayuno y comida para bebés. Por otra parte, la electroquímica es más adecuado para la miniaturización y la adaptación multi-array.

El acoplamiento de este enfoque con nanopartículas magnéticas también han mejorado las prestaciones de análisis y han demostrado ser especialmente adecuadas para la detección de contaminantes en muestras de alimentos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P9791
Disodium hydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
MgCl2 anhydrous	Sigma-Aldrich	M8266
DEA (99.5%)	Sigma-Aldrich	31589
HCl 37%	Sigma-Aldrich	320331
H3BO3	Sigma-Aldrich	B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane	Sigma-Aldrich	252859
BSA (albumin bovine serum)	Sigma-Aldrich	A4503
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
NaN3	Aldrich	71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt	Fluka	N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS):	Biopure	004050	The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxin	Biopure
Magnetic beads: Dynabeads®	Invitrogen	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4			Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8			Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5			Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5			Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05%			Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1%			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02%			Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate			Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution			Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution			Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution			Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions			Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH			Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody			Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody			Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S	Invitrogen
PalmSens instrument	PalmSens		Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Eight channel Mux electric contact			hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs)			hand made
Specially designed support for electrodes strip			hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes	Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes.	Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml.	Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer			Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room			Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.