Summary
Протокол для обнаружения трихотецены (микотоксины заботы о здоровье человека), используя недавно разработанный метод скрининга на основе конкурентных иммунохимического метода и окончательного выявления электрохимический продемонстрировано.
Abstract
Иммунологического являются реальной альтернативой более дорогим и трудоемким количественных ВЭЖХ или GC 1, 2 методы скрининга обнаружения опасных микотоксинов в пищевых товаров. В этом протоколе мы покажем, как изготовить и допросить электрохимической конкурентной Фермент связан иммуномагнитный анализ, основанный на использовании магнитных шариков в виде твердых поддержку иммунохимических цепочке 3 и трафаретной печатью электродов в качестве чувствительных платформы.
Наш метод имеет целью определить общую сумму НТ-2 и Т-2 токсины, микотоксины, принадлежащих трихотецены семьи и большой опасностью для здоровья человека 4. Использование антител клон с перекрестной реактивности на 100% по отношению к НТ-2 и Т-2 позволяет одновременно обнаруживать как токсины с аналогичными чувствительности 5.
Первым шагом нашего анализа является покрытие шаг, где мы обездвижить HT2-KLH сопряженных токсина на поверхности магнитных бус. После блокировки шаг, необходимо, чтобы избежать неспецифического поглощения, добавление моноклональных антител позволяет конкуренция между иммобилизованным НТ-2 и свободной HT-2 или Т-2 присутствует в образце или растворенные в стандартное решение.
В конце конкурса шаг, количество моноклональных антител связан с иммобилизованным НТ-2 будет обратно пропорциональна количеству токсина в растворе образца.
Вторичных антител, меченных щелочной фосфатазы (AP) используется, чтобы выявить связь между специфических антител и иммобилизованных НТ-2. Последним шагом измерения выполняются путем отказа аликвоту магнитной бусины подвески, соответствующие конкретного образца / стандартное решение, на поверхности трафаретной печати рабочего электрода; магнитных шариков закреплены и концентрированной с помощью магнитов размещены именно под трафаретной печати электрода. После двух минут инкубации между магнитными бусами и субстратом для AP, ферментативные продукция выявлена методом дифференциальной импульсной вольтамперометрии (DPV) с помощью портативного прибора (PalmSens) также может инициировать автоматическое восемь измерений с интервалом в несколько секунд.
Protocol
1) Блокировка покрытием магнитных шариков:
Выполните следующие блокировать покрытием Магнитные гранулы:
- Подготовить комплект из 2 мл пробирок Эппендорф;
- Однородный (встряхивания, но не вортексе) покрытием магнитных шариков (см. приложение для подготовки покрытием магнитных шариков), используя образец вращающийся смеситель;
- Сразу же после гомогенизации, пипетка 10 мкл покрытием магнитных гранул в каждой отдельной трубы Эппендорф;
- Добавить 1 мл обезжиренного молока блокирующий раствор в каждую пробирку Эппендорф множества;
- Давайте магнитных шариков инкубировать 30 минут при комнатной температуре на вращающемся образце смеситель;
- Удалите блокирующий раствор: для этого места трубки в магнитное концентратор частицы с магнитным часть положить на 2 мин (см. магнитных шариков прилипания на боковой стенке трубы); тщательно пипетки от супернатант, оставляя нетронутой бисером;
- Добавить 1 мл PBS буфера + NaN 3 + BSA, как решение для хранения данных для каждой трубки;
- Магазин покрытием и заблокировали магнитных гранул при температуре 4 ° С (обратите внимание, что покрытие магнитных шариков стабильны в течение не менее 2 месяцев при температуре 4 ° С);
2) Иммунологические цепи на магнитных шариков для построения калибровочной кривой и анализа проб
Выполните следующие иметь магнитных шариков готово для измерения:
- Возьмите одну трубку Эппендорф (2 мл) с покрытием и заблокировал решение для каждого образца экстракт вы собираетесь анализировать;
- Возьмите дополнительную трубку Eppendorf для каждой рабочей calibrant решения;
- Однородный магнитных гранул в течение 2 мин на вращающемся образце смесителя перед использованием;
- Удалить хранения жидкости с использованием магнитных частиц концентратора;
- Вымойте магнитных гранул в три раза с PBS / BSA моющего раствора. Удалить моющей жидкости;
- Конкурс шаг: Добавить для каждого пробирку мыть магнитных бус, 200 мкл образца экстракт готов; использовать один магнитный шарик трубки для каждого образца. Повторите эту процедуру для каждого стандартного раствора. Добавить 200 мкл моноклональных антител к решению каждой магнитной бусины трубки. Давайте магнитных шариков инкубировать в течение получаса на вращающемся образце смесителя при комнатной температуре;
- Удалить из труб Эппендорф раствор, используемый для конкуренции шаг;
- Маркировка шаг: Добавить 400μl меченых вторичных антител к каждой магнитной трубке шарик Эппендорф. Давайте магнитных шариков инкубировать в течение получаса на вращающемся образце смесителя при комнатной температуре;
- Удалить маркировки решение из труб Эппендорф;
- Вымойте магнитных гранул в три раза с PBS / Tween ® 20 промывочного раствора. Удалить жидкость;
- Ресуспендируют с 100 мкл буфера DEA каждую аликвоту магнитных бус. Теперь магнитных шариков готовы к шагу измерения электрохимических;
3) Ассамблеи PalmSens с мультиплексора (Mux) варианты
Внимание: продукт ферментативного гидролиза субстрата фолов поверхности электрода, по этой причине новый электрод, необходимые для каждого измерения.
- Подключить ноутбук к компьютеру PalmSens через последовательный кабель;
- Подключите 9-DIN вилка CH8 мультиплексор с PalmSens.
- Подключите последовательный кабель восьми каналов мультиплексора электрический контакт с CH8 мультиплексор;
- Место электрода полосы на восемь блоков магнита. Обратите внимание на место каждого магнита под каждого рабочего электрода (Следует отметить, что нуждается в одном магнитом для каждого электрода необходимо, в противном случае магнитные частицы не будут сосредоточены на рабочий электрод области);
- Подключите электроды полосы на восемь каналов мультиплексора электрического контакта;
Для измерения DPV использовать следующие параметры в соответствующих полях:
E начать: 0 (V), E конца: 0,6 (V), E шаг: 0,016 (V), E импульса: 0,0339 (V), E кондиционирования: 0 (V), E осаждения: 0 (V); Скорость сканирования : 0,1 (В / с); Т импульса: 0,06 (ы), T кондиционирования: 0 (с); Т осаждения: 0 (с); Т равновесия: 8 (ов).
4) ферментативной реакции и электрохимических измерений
- Однородный, осторожно встряхивая каждую пробирку Эппендорф, содержащих магнитные бусины готовы к шагу измерения электрохимических, чтобы получить хорошо рассеяны приостановлении магнитных шариков;
- Внесите друг от Эппендорф, сразу же после гомогенизации, аликвоту 20 мкл магнитной бусины дисперсии на соответствующие рабочие поверхности электрода. Для каждого из электродов одной полосы использовать 20 мкл магнитных шариков, взятых из разных труб Эппендорф (например, в течение восьми электрода используется восемь различных Эппендорф);
- Добавить 80 мкл раствора субстрата ферментативной на первый электрод. Начало 2 мин отсчет. Через 14 сек, добавить 80 мкл раствора субстрата ферментативной на втором электроде. После еще 14 сек, добавить 80 мкл раствора субстрата ферментативной на третий электрод. Выполните то же самое время Interval (14 секунд) до последнего электрода (что означает: снижение каждую аликвоту субстрата с интервалом в 14 сек). Интервал времени от 14 сек рассчитывается как время, необходимое для выполнения потенциостате измерения; отметить, 80 мкл раствора на каждый датчик должен охватывать работы, ведения и счетчик электрода. Более того, решения для каждого датчика не должны вступать в контакт с растворами соседних электродов.
- После 2 мин отсчет от первого добавлением ферментативного раствора субстрата, то производятся измерения электрохимических;
- Используйте PalmSens Lite программное обеспечение для получения текущих максимумов (мкА) для каждого решения.
5) Расчет
Создание калибровочной кривой использованием логистических 4 параметра уравнения и вычислить концентрацию общего HT-2/T-2 токсин сумму в нанограмм на миллилитр для каждой пробирки Эппендорф содержащие неизвестного образца.
Экспериментальным данным, высота пика (мкА) против концентрации calibrants (нг / мл), должны быть установлены использованием нелинейных четыре параметра логистической (4-PL) уравнения сюжет (1) (Sigma использованием Участок 8.0 или Kaleidagraph). Нелинейных 4-PL модель обычно применяется для описания связывание лигандов анализы (LBA) 6.
(1)
а, б, х0, у0 являются логистические параметры, как вид кривой Sigma программа поместиться участка.
Используйте эксплицируется формулу для расчета содержания HT-2/T-2 суммы общего токсина в разбавленный раствор экстракта образца 
(2)
х массовой концентрации общего количества HT-2/T-2 токсинов в разбавленный раствор экстракта, рассчитанные по логистическому уравнению 4 параметра в нанограмм на milliltre (нг / мл)
у является текущее значение в мкА, полученные для неизвестного образца
Приложение
6) покрытием магнитных шариков
Выполните следующие иметь покрытием Магнитные гранулы:
Стиральная процедуры
- Однородный tosylactivated Dynabeads ® M-280 (исходный раствор, 2 х 109 бусин / мл) при встряхивании и вортексе (максимальная скорость) в течение 1 мин (во избежание вспенивания) (обратите внимание, концентрация магнитных гранул должна быть всегда одинакова для обеспечения воспроизводимости измерения);
- Сразу же пипеткой 1 мл выше усредненных бисером в 2 трубки мл Eppendorf;
- Поместите пробирку в магнитных концентратор частицы с магнитным часть положить на 2 мин (см. магнитных шариков прилипания на боковой стенке трубы);
- Тщательно пипетки от супернатант, оставляя нетронутой бисером;
- Снимите трубку Eppendorf от магнитного концентратора частиц и ресуспендируйте бисером в 1 мл 0,1 М боратном буфере рН 9,5. Осторожно смешивать в течение 2 мин во вращающемся образце смесителя в течение 2 мин;
- Внесите от супернатант;
- Внесите 1 мл буферного раствора бората в пробирку Эппендорф. Магнитные гранулы теперь готовы для нанесения покрытий шаг;
Покрытие процедуры
- Добавить 600 мл НТ-2 сопряженных с KLH (Keyhole Лаймпет гемоцианин) маточного раствора к 1 мл магнитных шариков) (окончательный HT-2-KLH концентрации 375 мг / мл); инкубировать магнитных шариков и НТ-2-KLH решение для 20ч при 37 ° C * с медленным вращением наклона на вращающемся образце смеситель;
- После инкубации место трубки в магнитное концентратора частиц и пипетки с супернатант;
Мыть покрытие бусин в два раза с 1 мл PBS / BSA буферного раствора. Между каждого мытья удалить PBS / BSA решение. Все промывки проводили настройку магнитных бус и PBS / BSA на вращающемся смесителе в течение 5 мин; - Вымойте магнитных шариков один раз с использованием 1 мл Трис / BSA буферного раствора. Удалить ТРИС / BSA решение. Провести этот шаг, установив магнитных бус и ТРИС / BSA буфера на вращающемся смесителе в течение 4 часов при температуре 37 ° C *;
- Вымойте магнитных шариков один раз, используя 1мл обновляется (хранить в холодильнике при температуре 4 ° С) PBS / BSA буферного раствора. Удалить PBS / BSA решение. Провести этот шаг настройки магнитных бус и PBS / BSA буфера на вращающихся смеситель для 5 мин при комнатной температуре;
- После мытья шаг удалить все моющую жидкость и добавьте 1 мл PBS буфера + NaN 3 + BSA в качестве жидкого хранения;
- Магазин покрытием магнитных гранул при температуре 4 ° С (обратите внимание, что покрытие магнитных шариков стабильны в течение не менее 2 месяцев при температуре 4 ° С);
* Для этой цели миксер помещается в печь оснащена отверстие, которое позволяет вставлять кабель питания. Кроме микшера могут быть размещены в термостатируемой комнате при температуре 37 ° C.
7) подготовка проб и извлечения
25 г мелко образца грунта (детское питание или сухие завтраки), мыighed в банку блендер и экстрагируют 100 мл ацетонитрила / водный раствор (86/14) в течение 3 мин в высокоскоростной смеситель. После центрифугирования при 4000 оборотов в минуту (3000 г) в течение 5 мин, 8 мл надосадочной были приняты, и очищенная с колонкой Mycosep, 4 мл экстракта очищены сушат в токе азота. Высушенные образцы могут храниться при температуре от -30 ° C до нескольких месяцев.
8) Пример восстановления
Хлопья для завтрака
Развести сухой экстракт зерновых завтраков (зерновых пищевых продуктов на основе, предназначенные для потребления среди взрослых) с 40 мл PBS, рН 7,4. В этом случае образца с концентрацией токсина равно должны предельно допустимый уровень (200 нг / г) даст при измерении шаг сигнал падения в середине рабочего диапазона.
Детское питание
Развести сухой экстракт детского питания (зерновые пищевых продуктов на основе предназначенных для детского потребления) с 4 мл PBS. В этом случае образца с концентрацией токсинов равно должны предельно допустимый уровень (20-25 нг / г) даст при измерении шаг сигнал падения в середине рабочего диапазона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование антител, как биомолекулярных зонд признании видел широкое применение для зондирования; иммунохимических методик обнаружения, таких как ИФА и MEIAs, являются, в настоящее время, среди наиболее часто используемых и прикладных платформ во многих лабораториях 7.
Хотя эти подходы достичь исключительной чувствительностью и специфичностью, главной целью многих исследовательских групп в последние годы был улучшения и оптимизации их деятельности.
В этом протоколе мы показали, как в изготовлении и допросить immunosensor электрохимические для обнаружения микотоксинов. Мы считаем, что использование электрохимии развивать иммуно-сенсоров на основе окажется большее значение в будущем. Это связано с присущей преимущества электрохимической детекцией по оптическим. Электрохимии, на самом деле менее подвержены помехам и оказался крайне устойчив к неспецифической адсорбции и хорошо работать даже тогда, когда оспаривается в сложных матрицах образца, таких как зерновые завтраки и детское питание. Более того, электрохимии больше подходит к миниатюризации и несколькими массивами адаптации.
Связь такого подхода с магнитными наночастицами также улучшили аналитические выступления и зарекомендовали себя особенно хорошо подходит для обнаружения загрязнителей в пищевых образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Нэнси Даунер и все члены из лаборатории аналитической химии, Римский университет "Tor Vergata" за сотрудничество и тылового обеспечения. Эта работа была поддержана ЕС проекта "BioCop".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| MgCl2 anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DEA (99.5%) | Sigma-Aldrich | 31589 | |
| HCl 37% | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| H3BO3 | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Tris[hydroxymethyl]-aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| BSA (albumin bovine serum) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| NaN3 | Aldrich | 71290 | |
| 1-Naphthyl phosphate disodium salt | Fluka | N7255 | |
| Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS): | Biopure | 004050 | The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage. |
| Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml. | Vector Laboratories | AP-2000 | |
| HT-2 toxin | Biopure | ||
| Magnetic beads: Dynabeads® | Invitrogen | M-280 Tosylactivated | Concentration 2 x 109 beads/ml. |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water | ||
| Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 | Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water. | ||
| Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5 | Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water. | ||
| TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5 | Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water. | ||
| TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4 | Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use. | ||
| PBS buffer + TWEEN® 0.05% | Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4 | ||
| PBS buffer + BSA solution 0.1% | Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use. | ||
| PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02% | Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution | ||
| Enzymatic substrate | Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use. | ||
| Skimmed milk blocking solution | Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use. | ||
| HT-2 stock solution | Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C. | ||
| HT-2 Working standard solution | Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use. | ||
| HT-2 Working calibrant solutions | Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use. | ||
| HT-2 conjugated with KLH | Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C. | ||
| Specific Monoclonal Antibody | Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples. | ||
| Secondary Labeled Antibody | Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use. | ||
| Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S | Invitrogen | ||
| PalmSens instrument | PalmSens | Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software | |
| CH8 PalmSens Multiplexer | PalmSens | ||
| Eight channel Mux electric contact | hand made | ||
| Strip with eight screen printed electrodes (SPEs) | hand made | ||
| Specially designed support for electrodes strip | hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE | ||
| Calibrated microliter pipettes | Gilson, Inc. | ||
| Magnetic stirrer and stir bars. | |||
| Glass beakers (100, 50, 20 ml). | |||
| Volumetric flasks (2ml). | |||
| 0.2 and 2ml Eppendorf tubes. | Eppendorf | ||
| Falcon tubes of 5ml and 15ml. | Falcon BD | ||
| Laboratory Vortex Mixer | Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts | ||
| Laboratory oven or thermostated room | Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C. |
References
- Koch, P.
- Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals. Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).
- Morozova, T. Y., Morozov, V. N. Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads. Anal. Biochem. , 263-271 (2008).
- FAO Food and Nutrition Paper 74. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. 2001 Feb 6-15, Geneva, , Food & Agricultural Organization of the United Nations. 115 (2001).
- Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study. Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l, Palleschi, G. A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis. Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).
