Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem

Summary

Trichothecenes (insan sağlığı için endişe mikotoksinler) rekabetçi bir immünokimyasal yöntemi ve bir final elektrokimyasal algılama dayalı yeni geliştirilen bir tarama yöntemi kullanılarak tespit etmek için bir protokol olduğunu göstermiştir.

Abstract

Immunoassay daha pahalı ve zaman alıcı kantitatif HPLC veya GC ^{1 2 yöntem,} gıda malları tehlikeli mikotoksinler tarama algılama için geçerli bir alternatif. Bu protokolde algılama platformu olarak immünokimyasal zinciri ³ ve serigrafi elektrotlar için sağlam bir destek olarak manyetik boncuk kullanımı dayalı bağlantılı immunomagnetic tahlil imal ve rekabetçi bir elektrokimyasal Enzim sorguya nasıl göstermektedir.

Bizim yöntemi HT-2 ve T-2 toksinleri trichothecenes aile ve insan sağlığı ⁴ için büyük bir endişe ait toplam tutarı, mikotoksinler belirlenmesi amaçlanmıştır. % 100 HT-2 ve T-2 doğru bir çapraz reaksiyon ile bir antikor klon benzer hassasiyet ⁵ ile aynı anda iki toksinler tespit etmek için sağlar .

Testinin ilk adım, biz yüzey üzerinde manyetik boncuk HT2-KLH konjuge toksin hareketsiz kaplama adımdır. Immobilize HT-2 ve HT-2 ya da T-2 örnek ücretsiz mevcut veya standart bir çözüm çözünmüş arasındaki rekabet, non-spesifik emme önlemek için gerekli engelleyici bir adım sonra, monoklonal antikor Ayrıca sağlar.

Rekabet adım sonunda, monoklonal antikor miktarı ile bağlantılı HT-2 örnek çözüm toksin miktarı ile ters orantılı olacaktır immobilize.

Alkalen fosfataz (AP) ile etiketlenmiş ikincil bir antikor spesifik antikor ve hareketsiz HT-2 arasındaki bağlayıcı ortaya çıkarmak için kullanılır. Son ölçüm adım ekran baskılı bir çalışma elektrot yüzeyinde belirli bir örnek / standart bir çözüm karşılık, manyetik boncuk süspansiyonu bir kısım bırakarak yapılır; altında tam olarak yerleştirilen bir mıknatıs sayesinde manyetik boncuk immobilize ve konsantre ekran basılmış elektrot. Manyetik boncuk ve AP için bir substrat arasında kuluçka iki dakika sonra, enzimatik ürün birkaç saniye bir süre içinde otomatik olarak sekiz ölçümler başlatmak için ayrıca taşınabilir bir enstrüman (PalmSens) kullanarak Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) tarafından algılanır.

Protocol

1) Engelleme kaplı Manyetik Boncuk:

Kaplı Manyetik boncuk engellemek için takip devam edin:

1. 2 ml Eppendorf tüpleri bir dizi hazırlamak;
2. (Vorteks sıkıyorlar ama) örnek dönen mikser ile kaplı manyetik bilye (kaplı manyetik boncuk hazırlanması için eke bakınız) homojenize
3. Homojenizasyon hemen sonra, her biri ayrı Eppendorf tüp içine kaplı manyetik bilye pipet 10 ul;
4. Kümesinin her Eppendorf tüp içine çözümü engelleme yağsız süt 1 ml ekleyin;
5. Dönen örnek karıştırıcı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe manyetik boncuk edelim;
6. Çözümü engelleme kaldır: 2 dk (tüp lateral duvara yapışan manyetik boncuk görmek) koymak manyetik manyetik partikül konsantratör tüp bunu dikkatle boncuk bozulmamış bırakarak, süpernatantı pipetle;
7. PBS + NaN ₃ + BSA her tüp için depolama çözümü olarak 1 ml ekleyin;
8. 4 kaplı ve bloke manyetik boncuk Mağaza ° C (kaplı manyetik boncuk 4 ° C 'de en az 2 ay için kararlı olduğunu lütfen unutmayın);

2) kalibrasyon eğrisi inşaat ve numune analizi için manyetik boncuk İmmünolojik zinciri

Ölçümü için hazır manyetik boncuklar var aşağıdaki gibi devam edin:

1. Kaplı ve bloke çözüm, analiz için gidiyoruz her örnek ayıklamak için bir Eppendorf tüp (2 ml) ele alalım;
2. Her çalışma kalibrant çözeltisi için ekstra bir Eppendorf tüp;
3. Manyetik boncuk, kullanmadan önce dönen bir örnek karıştırıcı 2 dakika süreyle homojenize;
4. Manyetik parçacık konsantratör kullanarak depolama sıvı çıkarın;
5. PBS / BSA yıkama solüsyonu ile manyetik bilyeler üç kez yıkayın. Sıvı çamaşır çıkarın;
6. Rekabet adım: yıkanmış manyetik boncuk, örnek hazırlanmış ayıklamak 200μl içeren her tüp için ekleyin; her bir örnek için bir manyetik boncuk tüp kullanın. Her bir standart çözüm için aynı prosedürü tekrarlayın. Her manyetik boncuk tüp 200 ul monoklonal antikor çözüm ekleyin. Manyetik boncuk, oda sıcaklığında dönen örnek karıştırıcı yarım saat boyunca inkübe edelim;
7. Eppendorf tüpleri rekabet adım için kullanılan çözüm çıkarın;
8. Adım Etiketleme: Her bir manyetik boncuk Eppendorf tüp etiketli ikincil antikor 400μl ekle . Manyetik boncuk, oda sıcaklığında dönen örnek karıştırıcı yarım saat boyunca inkübe edelim;
9. Eppendorf tüpleri çözümü etiketleme çıkarın;
10. Manyetik boncuk, PBS / TWEEN ® 20 yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın. Sıvı çıkarın;
11. DEA tampon 100μl manyetik boncuklar her kısım süspanse edin. Şimdi manyetik boncuk elektrokimyasal ölçüm adım için hazır;

3) Meclis Çoklayıcı (Mux) seçenekleri ile PalmSens

Lütfen dikkat: substrat hidrolizi enzimatik ürün elektrot yüzeyi fauller, bu nedenle yeni bir elektrot her bir ölçüm için gerekli.

1. PalmSens seri kablo aracılığıyla bir PC dizüstü bağlayın;
2. PalmSens CH8 Multiplexer 9-DIN fişini.
3. CH8 Multiplexer ile sekiz kanal Mux elektrik kontağı seri kablo bağlayın;
4. Sekiz mıknatıs blok yerleştirin elektrot şerit. Mıknatıs her çalışma elektrotları altında her yere dikkat edin (not, her elektrot için tek bir mıknatısın manyetik parçacık aksi çalışma elektrot alana konsantre olmaz şarttır);
5. Sekiz kanal Mux elektrik temas elektrotlar şerit takın;

DPV ölçümü için uygun kutulara aşağıdaki parametreleri kullanın:
E başlar: 0 (V); E sonu: 0.6 (V); D adım: 0.016 (V); E darbe: 0,0339 (V); E Klima: 0 (V); E birikimi: 0 (V); Tarama hızı : 0.1 (V / s); T darbe: 0.06 (lar); T Klima: 0 (lar); birikimi T: 0 (s), T dengeleme: 8 (ler).

4) Enzimatik reaksiyon ve Elektrokimyasal Ölçüm

1. Eppendorf tüp manyetik boncuk iyi dağılmış bir süspansiyon elde etmek için elektrokimyasal ölçüm adım için hazır manyetik boncuk içeren her hafifçe sallayarak homojenize;
2. Homojenizasyon sonra hemen her Eppendorf Pipet, ilgili çalışma elektrot yüzeyine manyetik boncuk dağılım 20 ul bir kısım. 20 farklı Eppendorf tüpleri (örneğin sekiz elektrot kullanımı sekiz farklı Eppendorf) alınan manyetik boncuk ul bir şerit kullanımı her elektrot için;
3. Ilk elektrot üzerinde 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. 2 dakika geri sayım başlayın. 14 saniye sonra ikinci bir elektrot 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. Daha fazla 14 saniye sonra, üçüncü elektrot 80 ul enzimatik substrat çözeltisi ekleyin. Aynı zamanda int devamerval son elektrot (: 14 sn aralıklarla substrat her bir kısım düşmesi anlamına gelir) kadar (14 saniye). 14 saniye zaman aralığı potansiyostat ölçüm gerçekleştirmek için gerekli olan süre olarak hesaplanır; nota, her bir sensör 80 ul çözüm, çalışma ve referans elektrot kapsamalıdır. Ayrıca, her bir sensör için çözümler komşu elektrot çözümleri ile temas edilmemelidir.
4. 2 dk enzimatik substrat çözeltisi ilk ek geri sayım sonra, elektrokimyasal ölçümü başlatmak;
5. Her çözüm için geçerli zirveleri (uA) elde etmek için PalmSens Lite yazılımı kullanın.

5) Hesaplama

Bir lojistik 4 parametreleri denklemi kullanarak bir kalibrasyon eğrisinin oluşturulması ve bilinmeyen numuneyi içeren her Eppendorf tüp mililitrede nanogram HT-2/T-2 toksin miktarı toplam konsantrasyonu hesaplamak.

Calibrants konsantrasyonu (ng / ml) karşı tepe yüksekliği (uA), deneysel veriler, doğrusal olmayan dört parametreli lojistik Sigma Arsa 8.0 veya kullanarak denklem arsa (1) ((4-PL) kullanarak takılacak Kaleidagraph). Doğrusal olmayan 4-PL modeli genellikle ligand bağlayıcı deneyleri (LBAs) ⁶ tanımlamak için benimsenmiştir.

(1)
Sigma Arsa eğrisi uyum programı tarafından verilen a, b, y0 lojistik parametreleri x0 vardır.
Seyreltilmiş numune ekstresi çözümü HT-2/T-2 toksin toplam miktarın içeriğini hesaplamak için açiklanabilir formülü kullanın
(2)
x milliltre ortalama nanogram lojistik 4 parametreleri Denklem (ng / ml) hesaplanan Seyreltilmiş ekstrakt çözüm HT-2/T-2 toksinlerin toplam miktarın kütle konsantrasyonu
y uA geçerli değeri bilinmeyen numune için elde edilen

Ek

6) Kaplı Manyetik Boncuklar

Kaplamalı Manyetik boncuklar var aşağıdaki gibi devam edin:

Prosedürü Yıkama

1. Tosylactivated Dynabeads homojenize ® M-280 (stok solüsyonu 2 x 109 boncuk / ml) 1 dakika (köpük kaçının) (lütfen manyetik boncuk konsantrasyon sağlamak için tekrarlanabilirliği her zaman aynı olması gereken sallayarak ve vorteks (maksimum hız) ölçümü);
2. Hemen 2 ml Eppendorf tüpe 1 mL pipetle yukarıdaki homojenize boncuk;
3. 2 dk (tüp lateral duvara yapışan manyetik boncuk görmek) koymak manyetik manyetik partikül konsantratör tüp Yeri;
4. Dikkatlice boncuk bozulmamış bırakarak, süpernatantı pipetle;
5. Eppendorf tüp manyetik parçacık konsantratör çıkarın ve 1 ml 0,1 M borat tamponu pH 9.5 boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. 2 dakika süreyle, 2 dakika süreyle dönen örnek mikserde yavaşça karıştırın;
6. Süpernatantı kapalı Pipet;
7. Pipet borat tampon çözelti Eppendorf tüp içine 1 ml. Manyetik boncuk kaplama adım için hazır;

Kaplama prosedürü

8. Inkübe manyetik boncuk ve HT-2-KLH çözümü için; KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok manyetik boncuk, 1 ml çözelti) (375 mg / ml son HT-2-KLH konsantrasyon) ile HT-2 konjuge 600 ml 20h 37 ° C * Örnek mikser dönen yavaş eğim rotasyon;
9. Inkübasyon yer süpernatantı kapalı manyetik parçacık konsantratör ve pipet tüp sonra;
   1 ml PBS / BSA tampon çözelti ile kaplı boncuklar iki kez yıkayın. Her yıkama arasında PBS / BSA çözüm çıkarın. Tüm yıkama adım 5 dakika boyunca devirli manyetik boncuk ve PBS / BSA yapıldı;
10. 1 ml TRIS / BSA tampon çözeltisi kullanılarak manyetik boncuk bir kez yıkayın. TRIS / BSA çözüm çıkarın. 37 az 4 saat süreyle mikser dönen manyetik boncuk ve TRIS / BSA tampon ayarlayarak bu adımı yürütmek ° C;
11. Yenilenir 1 ml (4 ° C) PBS / BSA tampon çözelti buzdolabında saklanır kullanarak manyetik boncuk bir kez yıkayın PBS / BSA çözüm çıkarın. Oda sıcaklığında 5min için mikser dönen manyetik boncuk ve PBS / BSA tampon bu adımı yürütmek;
12. Adım, tüm yıkama sıvı eklemek kaldırmak ve yıkadıktan sonra 1 ml PBS + NaN ₃ + BSA depolama sıvı olarak;
13. Kaplı manyetik bilye Mağaza, 4 ° C (kaplı manyetik boncuk 4 en az 2 ay için kararlı olduğunu lütfen unutmayın ° C);

* Bu amaç için güç kaynağı için kablo ekleme sağlayan bir delik ile donatılmış fırında karıştırıcı yerleştirilir. Alternatif olarak, mikser ° C 37 ° mostatlı bir odada yer olabilir

7) Numune hazırlama ve ekstraksiyon

25 g (bebek maması ya da kahvaltılık tahıllar) ince öğütülmüş örnekblender kavanoza ighed ve yüksek-hızlı blender 3 dakika asetonitril / su solüsyonu (86/14) 100 ml ile ekstrakte. 5 dakika için 4000 rpm (3000 gr), 8 ml süpernatant Mycosep sütun ile çekilen ve saflaştırılmış santrifüj sonra, temizlenmiş özü 4 ml azot akışı altında kurutuldu. Kurutulmuş numuneler -30 ° C'de birkaç ay saklanabilir.

8) Örnek sulandırıldıktan

Kahvaltılık tahıl ürünleri

Sulandırın 40 ml PBS pH 7.4 ile kuru kahvaltı gevreği ekstresi (tahıl bazlı gıda yetişkin tüketimi için mukadder). Bu şekilde sözde yasal sınırın (200 ng / g) eşit toksin konsantrasyonu ile örnek bir çalışma aralığı ortasına düşen bir sinyal ölçüm adımda verecektir.

Bebek maması

4 ml PBS ile sulandırın kurutulmuş bebek maması ekstresi (tahıl bazlı gıda bebek tüketimi için mukadder). Bu şekilde sözde yasal sınırın (20-25 ng / g) eşit toksinlerin bir konsantrasyon ile örnek bir çalışma aralığı ortasına düşen bir sinyal ölçüm adımda verecektir.

Discussion

Biyomoleküler tanıma prob olarak antikorların kullanımı yaygın bir algılama teknolojileri kullanımı gördü; ELISA'larla ve MEIAs immünokimyasal algılama yöntemleri, en çok kullanılan ve uygulanan birçok laboratuvarda ⁷ platformlar arasında, günümüzde,.

Bu yaklaşımların son yıllarda olağanüstü bir duyarlılık ve özgüllük, birçok araştırma grubu birincil hedefi elde ederken, kendi performansları ve iyileştirme ve optimizasyon olmuştur.

Bu protokolde mikotoksin tespiti için bir elektrokimyasal immunosensor imal ve sorgulamak için nasıl göstermiştir. Biz immuno tabanlı sensörler geliştirmek için elektrokimya kullanımı gelecekte artan önemi olacağına inanıyoruz. Bu, optik biri üzerinde elektrokimyasal algılama özgü avantajları nedeniyle. Elektrokimya aslında parazite karşı daha az eğilimli ve non-spesifik adsorpsiyon karşı son derece dayanıklı kanıtlanmış ve kahvaltı gevreği ve bebek maması gibi karmaşık örnek matrikslerde meydan bile iyi bir performans sergiliyor. Ayrıca, elektrokimya minyatür ve çok dizi adaptasyon için daha uygundur.

Manyetik nanoparçacıkların ile kaplin böyle bir yaklaşım, aynı zamanda analitik performansları geliştirilmiş ve özellikle gıda örnekleri bulunan kirleticilerin tespiti için uygun olduğu kanıtlanmıştır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P9791
Disodium hydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
MgCl2 anhydrous	Sigma-Aldrich	M8266
DEA (99.5%)	Sigma-Aldrich	31589
HCl 37%	Sigma-Aldrich	320331
H3BO3	Sigma-Aldrich	B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane	Sigma-Aldrich	252859
BSA (albumin bovine serum)	Sigma-Aldrich	A4503
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
NaN3	Aldrich	71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt	Fluka	N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS):	Biopure	004050	The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxin	Biopure
Magnetic beads: Dynabeads®	Invitrogen	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4			Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8			Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5			Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5			Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05%			Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1%			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02%			Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate			Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution			Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution			Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution			Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions			Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH			Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody			Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody			Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S	Invitrogen
PalmSens instrument	PalmSens		Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Eight channel Mux electric contact			hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs)			hand made
Specially designed support for electrodes strip			hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes	Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes.	Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml.	Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer			Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room			Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.