ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrokemiska) Metod för Mykotoxin Detection

Summary

Ett protokoll för att upptäcka trikotecener (mykotoxiner risk för människors hälsa) med hjälp av en nyutvecklad screening metod som bygger på en konkurrenskraftig immunokemisk metod och en slutlig elektrokemisk detektion visas.

Abstract

Immunologiska metoder ett bra alternativ till dyrare och mer tidskrävande kvantitativa HPLC eller GC ^{1, 2} metoder för screening upptäcka farliga mykotoxiner i livsmedelsråvaror. I detta protokoll visar vi hur du tillverka och förhöra en elektrokemisk konkurrenskraftig enzymlänkad immunomagnetic analys baseras på användning av magnetiska kulor som fast stöd för immunokemiska kedjan ³ och screentryck elektroder som sensorer plattform.

Vår metod är att bestämma den totala mängden HT-2 och T-2-toxiner mykotoxiner tillhör trikotecener familjen och av stor betydelse för människors hälsa ^4. Användningen av en antikropp klon med en korsreaktivitet på 100% mot HT-2 och T-2 gör det möjligt att samtidigt upptäcka både gifter med liknande känslighet ^5.

Det första steget i vår analys är beläggningen steg där vi immobilisera HT2-KLH konjugat gift på ytan av magnetiska kulor. Efter en blockerande steg krävs för att undvika icke-specifik absorptioner, kan tillägg av en monoklonal antikropp konkurrensen mellan immobiliserade HT-2 och gratis HT-2-eller T-2 som finns i provet eller lösta i någon standardlösning.

I slutet av tävlingen steg, mängden monoklonal antikropp kopplad till immobiliserade HT-2 kommer att vara i omvänd proportion till mängden toxin i provlösningen.

En sekundär antikropp märkt med alkalisk fosfatas (AP) används för att avslöja bindande mellan den specifika antikroppen och den immobiliserade HT-2. Det sista mätningen steget utförs genom att släppa en delmängd av magnetiska pärlor fjädring, motsvarar en specifik prov / standardlösning, på ytan av en screentryckt arbetande elektrod, magnetiska kulor är orörlig och koncentrerad med hjälp av en magnet placeras exakt enligt screentryckt elektrod. Efter två minuters inkubation mellan magnetiska pärlor och ett substrat för AP, är den enzymatiska produkt upptäckts av Differential Pulse Voltammetry (DPV) med ett portabelt instrument (PalmSens) också kunna initiera automatiskt åtta mätningar inom ett intervall på några sekunder.

Protocol

1) Blockering belagd magnetiska kulor:

Gör så här för att blockera Coated magnetiska kulor:

1. Bered en serie på 2 ml Eppendorf-rör;
2. Homogenisera (skaka men inte vortexa) belagd magnetiska kulor (se appendix för beredning av belagd magnetiska kulor) med provet roterande mixern;
3. Omedelbart efter homogenisering, Pipettera 10 ìl av belagd magnetiska kulor i varje enskild Eppendorf-rör;
4. Tillsätt 1 ml skummjölk blockera lösning i varje Eppendorf-rör i uppsättningen;
5. Låt magnetiska kulor inkubera i 30 minuter i rumstemperatur på den roterande urval mixer;
6. Ta bort blockerande lösningen: att göra så placera röret i magnetisk partikel anrikningsverk med den magnetiska delen sätta på i 2 min (se magnetiska kulor fastnar på sidovägg av röret), försiktigt pipett bort supernatanten och lämna pärlor ostört;
7. Tillsätt 1 ml PBS-buffert + NaN ₃ + BSA som lagringslösning för varje rör;
8. Förvara bestruket och blockerade magnetiska kulor vid 4 ° C (observera att belagda magnetiska kulor är stabil i minst 2 månader vid 4 ° C);

2) Immunologiska kedjan på magnetiska kulor för konstruktion av kalibreringskurvan och provanalys

Gör så här att ha magnetiska kulor redo för mätning:

1. Ta ett Eppendorf-rör (2 ml) av belagda och blockerade lösning för varje provextrakt du kommer att analysera;
2. Ta en extra Eppendorf-rör för varje arbetsdag kalibreringsstandard lösning;
3. Homogenisera magnetiska kulor i 2 min på den roterande urval mixer före användning;
4. Ta bort lager flytande med hjälp av magnetisk partikel koncentrator;
5. Tvätta magnetiska kulor tre gånger med PBS / BSA tvättlösning. Ta bort tvättmedel;
6. Konkurrensen steg: Lägg till för varje rör innehåller tvättade magnetiska kulor 200μl av provextraktets beredda, använda en magnetisk pärla rör för varje prov. Upprepa samma procedur för varje standardlösning. Tillsätt 200 ìl monoklonal antikropp lösning till varje magnetiska pärla rör. Låt magnetiska kulor inkubera i en halvtimme på den roterande urval blandare vid rumstemperatur;
7. Ta bort från Eppendorf rör den lösning som används för tävlingen steg;
8. Märkning steg: Lägg 400μl av märkt sekundär antikropp till varje magnetiska pärla Eppendorf-rör. Låt magnetiska kulor inkubera i en halvtimme på den roterande urval blandare vid rumstemperatur;
9. Ta bort märkning lösning från Eppendorf-rör;
10. Tvätta magnetiska kulor tre gånger med PBS / Tween ® 20 tvättlösning. Avlägsna vätskan;
11. Resuspendera med 100μl av DEA buffert varje alikvot av magnetiska pärlor. Nu magnetiska kulor är redo för elektrokemisk mätning steg;

3) Montering av PalmSens med multiplexer (Mux) optioner

Observera: enzymatisk produkt av substrat hydrolys fouls elektroden ytan, av den anledningen en ny elektrod behövs för varje mätning.

1. Anslut en PC laptop till PalmSens via den seriella kabeln;
2. Anslut 9-DIN-kontakt för CH8 Multiplexer med PalmSens.
3. Anslut seriekabel av åtta kanaler Mux elektrisk kontakt med CH8 Multiplexer;
4. Placera elektroden band på åtta magneten blocket. Var uppmärksam på plats varje magnet under varje arbeta elektroder (att notera, är behovet av en enda magnet för varje elektrod viktigt annars magnetiska partiklar inte kommer att koncentreras på att arbeta elektroderna);
5. Anslut elektroderna band i åtta kanaler Mux elektriska kontakten;

För DPV mätning använder följande parametrar i rutorna:
E börjar: 0 (V), E slut: 0,6 (V), E steget: 0,016 (V), E puls: 0,0339 (V), E Luftkonditionering: 0 (V), E nedfall: 0 (V), avsökningshastighet : 0,1 (V / s), T puls: 0,06 (s), T Luftkonditionering: 0 (s), T nedfall: 0 (s), T jämvikt: 8 (s).

4) enzymatiska reaktionen och elektrokemisk mätning

1. Homogenisera genom att försiktigt skaka varje Eppendorf-rör som innehåller magnetiska kulor redo för elektrokemiska mätningar steg för att få en väl spridd avstängning av magnetiska pärlor;
2. Pipettera från varje Eppendorf, omedelbart efter homogenisering, en alikvot av 20 ìl av magnetiska pärla spridning på motsvarande arbetar elektroden yta. För varje elektrod i en remsa använda 20 ìl av magnetiska kulor från olika Eppendorf-rör (t.ex. för åtta elektrod använder åtta olika Eppendorf);
3. Tillsätt 80 ìl av enzymatisk substratlösning på första elektroden. Start 2 min räkna ner. Efter 14 sek, tillsätt 80 ìl av enzymatisk substratlösning på den andra elektroden. Efter ytterligare 14 sek, tillsätt 80 ìl av enzymatisk substratlösning den tredje elektroden. Fortsätt på samma gång interval (14 sekunder) tills den sista elektroden (det betyder: släpp varje alikvot av substrat med intervaller på 14 sek). Intervallet tid 14 sek beräknas som den tid som krävs av potentiostat att utföra mätningen, att notera bör 80 l lösning för varje sensor täcka de arbetande, referens och disk elektrod. Dessutom bör lösningar för varje sensor inte komma i kontakt med lösningar av närliggande elektroder.
4. Efter 2 min räkna ner från det första tillägget av enzymatisk substratlösning, starta elektrokemiska mätningen;
5. Använd PalmSens Lite skaffa aktuell toppar (μA) för varje lösning.

5) Beräkning

Fastställ en kalibreringskurva med hjälp av en logistisk 4 parametrar ekvation och beräkna koncentrationen av totala HT-2/T-2 toxin belopp i nanogram per milliliter för varje Eppendorf-rör med okänt prov.

Den experimentella data, topphöjd (μA) mot koncentrationen av kalibreringsstandarderna (ng / ml), måste vara utrustade med en icke-linjär fyra-parametern logistiska (4-PL) ekvationen plot (1) (med hjälp av Sigma Plot 8,0 eller Kaleidagraph). Den olinjära 4-PL-modellen är vanligtvis antas att beskriva ligandbindande analyser (LBAS) ^6.

(1)
a, b, x0, y0 är logistiska parametrar som ges av Sigma Rita kurvan passar programmet.
Använd preciserades formel för att beräkna halten av HT-2/T-2 toxin totala beloppet i det utspädda provet extraktlösning
(2)
X är massan koncentrationen av den totala mängden HT-2/T-2 toxiner i det utspädda extraktet lösningen, räknat från den logistiska 4 parametrarna ekvationen i nanogram per milliltre (ng / ml)
y är aktuella värdet i μA erhållits för det okända provet

Bilaga

6) Bestruket magnetiska kulor

Gör så här att ha Coated magnetiska kulor:

Tvätt förfarande

1. Homogenisera tosylactivated Dynabeads ® M-280 (stamlösning 2 x 109 pärlor / ml) genom att skaka och vortexa (max hastighet) under 1 minut (undvika skumbildning) (notera koncentrationen av magnetiska kulor måste alltid densamma för att säkerställa reproducerbarhet i mätningen);
2. Omedelbart Pipettera 1 ml av ovanstående homogeniserade kulor i en 2 ml Eppendorf-rör;
3. Placera röret i magnetisk partikel anrikningsverk med den magnetiska delen sätta på i 2 min (se magnetiska kulor fastnar på sidovägg av röret);
4. Försiktigt pipett bort supernatanten och lämna pärlor ostört;
5. Ta bort Eppendorf-rör från den magnetiska partikel koncentrator och återsuspendera pärlor i 1 ml 0,1 M boratbuffert pH 9,5. Blanda försiktigt i 2 min i den roterande urval blandare i 2 min;
6. Pipettera av supernatanten;
7. Pipettera 1 ml boratbuffert lösning i Eppendorf-rör. Magnetiska kulor är nu redo för beläggning steg;

Beläggning förfarande

8. Tillsätt 600 ml av HT-2-konjugerat med KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stamlösning till 1 ml av magnetiska kulor) (sista HT-2-KLH koncentration av 375 mg / ml), inkubera magnetiska kulor och HT-2-KLH lösning för 20h vid 37 ° C * med långsam lutning rotation på roterande urval mixer;
9. Efter inkubation placera röret i den magnetiska partiklar koncentrator och pipettera bort supernatanten;
   Tvätta belagda pärlor två gånger med 1 ml PBS / BSA buffertlösning. Mellan varje tvätt bort PBS / BSA-lösning. Alla tvätt utfördes inställning magnetiska kulor och PBS / BSA på roterande mixern i 5 min;
10. Tvätta magnetiska kulor gång med 1 ml Tris / BSA buffertlösning. Ta bort Tris / BSA-lösning. Utför detta steg genom att sätta magnetiska pärlor och Tris / BSA buffert på roterande blandare i 4 h vid 37 ° C *;
11. Tvätta magnetiska kulor gång med 1 ml uppfriskad (förvaras i kylskåp vid 4 ° C) PBS / BSA buffertlösning. Ta bort PBS / BSA-lösning. Utför detta steg inställning magnetiska kulor och PBS / BSA-buffert på roterande blandare för 5min vid rumstemperatur;
12. Efter tvättning steg bort alla tvättmedel och tillsätt 1 ml PBS-buffert + NaN ₃ + BSA som lagring flytande;
13. Förvara bestruket magnetiska kulor vid 4 ° C (observera att belagda magnetiska kulor är stabil i minst 2 månader vid 4 ° C);

* För detta ändamål blandaren är placerad i ugn försedd med ett hål som tillåter införandet av kabeln för strömförsörjningen. Alternativt mixern kunde placeras i en termostat rum vid 37 ° C.

7) Provberedning och utvinning

25 g finmalen prov (barnmat eller frukostflingor) är viighed i en mixer burk och extraheras med 100 ml acetonitril / vatten lösning (86/14) i 3 min i en hög hastighet mixer. Efter centrifugering vid 4000 rpm (3000 g) i 5 min, 8 ml av supernatanten togs och renas med Mycosep kolumn var 4 ml av rengöras extraktet torkas under kväve flöde. Torkade prover kan förvaras vid -30 ° C upp till flera månader.

8) Exempel på beredning

Frukostflingor

Rekonstituera torkade frukostflingor extrakt (spannmålsbaserade foder som är avsett för vuxna konsumtion) med 40 ml PBS pH 7,4. På detta sätt ett prov med en koncentration av toxin lika med det förment lagliga gränsen (200 ng / g) ger i mätningen steg en signal faller i mitten av arbetsområdet.

Babymat

Rekonstituera torkade barnmat extrakt (spannmålsbaserade livsmedel avsedda för spädbarn konsumtion) med 4 ml PBS. På detta sätt ett prov med en koncentration av gifter som motsvarar den förmodade lagliga gränsen (20-25 ng / g) ger i mätningen steg en signal faller i mitten av arbetsområdet.

Discussion

Användningen av antikroppar som biomolekylära erkännande sond har sett en utbredd användning för sensorteknik, immunokemiska upptäckt metoder, såsom Elisa-test och MEIAs, är numera bland de mest använda och tillämpas plattformar i många laboratorier ^7.

Även om dessa metoder att uppnå exceptionell känslighet och specificitet, ett primärt mål för många forskargrupper under de senaste åren har varit den förbättring och optimering av sina framföranden.

I detta protokoll har vi visat hur man kan tillverka och förhöra en elektrokemisk immunosensor för mykotoxiner upptäckt. Vi tror att användningen av elektrokemi för att utveckla immuno-baserade sensorer kommer att visa sig vara av större betydelse i framtiden. Detta beror på den inneboende fördelarna med elektrokemisk detektion över den optiska en. Elektrokemi är i själva verket mindre benägna att störningar och har visat sig anmärkningsvärt robust mot den icke-specifika adsorption och prestera bra även när utmanas i komplexa prov matriser såsom frukostflingor och barnmat. Dessutom är elektrokemi mer lämpad för miniatyrisering och multi-array anpassning.

Kopplingen av en sådan strategi med magnetiska nanopartiklar har också förbättrat de analytiska föreställningar och har visat sig vara särskilt lämpad för främmande ämnen upptäckt i livsmedelsprover.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P9791
Disodium hydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
MgCl2 anhydrous	Sigma-Aldrich	M8266
DEA (99.5%)	Sigma-Aldrich	31589
HCl 37%	Sigma-Aldrich	320331
H3BO3	Sigma-Aldrich	B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane	Sigma-Aldrich	252859
BSA (albumin bovine serum)	Sigma-Aldrich	A4503
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
NaN3	Aldrich	71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt	Fluka	N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS):	Biopure	004050	The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxin	Biopure
Magnetic beads: Dynabeads®	Invitrogen	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4			Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8			Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5			Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5			Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05%			Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1%			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02%			Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate			Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution			Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution			Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution			Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions			Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH			Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody			Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody			Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S	Invitrogen
PalmSens instrument	PalmSens		Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Eight channel Mux electric contact			hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs)			hand made
Specially designed support for electrodes strip			hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes	Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes.	Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml.	Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer			Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room			Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.