ELIME（免疫磁気電気化学的にリンクされた酵素）マイコトキシンの検出方法

Summary

競争力のある免疫化学的方法に基づいて新たに開発されたスクリーニング方法を用いてトリコテセン（ヒトの健康に対する懸念のマイコトキシン）を検出すると、最終的な電気化学的検出が実証されているプロトコル。

Abstract

イムノアッセイは、より高価で時間のかかる定量的なHPLCやGC ^1、食料品の危険なマイコトキシンのスクリーニング検出のための^2つの方法への有効な代替手段です。このプロトコルでは、プラットフォームを感知するなど、免疫化学チェーン³とスクリーン印刷電極の固体支持体として磁性ビーズの使用に基づいて、リンクされた免疫アッセイを作製し、電気化学的競争力のある酵素を尋問する方法を示します。

提案手法では、HT - 2とT - 2毒素の総量、トリコテセンの家族と人間の健康⁴の大きな懸念の属するマイコトキシンを決定することを目的とする。 HT - 2とT - 2に向かって100％の交差反応性抗体のクローンの使用は、同時に同じような感度⁵で両方の毒素を検出することができます。

私たちの分析の最初のステップは、我々は磁気ビーズの表面にHT2 - KLH複合体の毒素を固定化コーティングのステップです。非固有の吸収を避けるために必要なブロッキングのステップ、後に、モノクローナル抗体の添加は、HT - 2とフリーHT - 2やT - 2試料中に存在するか、標準液に溶解固定化との間の競争が可能になります。

競争のステップの終了時に、固定化HT - 2にリンクされているモノクローナル抗体の量は、試料溶液中の毒素の量に反比例します。

アルカリホスファターゼ（AP）で標識二次抗体を特異的抗体と固定化HT - 2の間の結合を明らかにするために使用されます。最後の測定ステップは、スクリーン印刷された作用電極の表面に、特定のサンプル/標準溶液に対応する磁気ビーズ懸濁液のアリコートを、ドロップすることによって実行されます。磁気ビーズは、下に正確に配置磁石により固定化し、そして濃縮されていますスクリーン印刷電極。磁気ビーズとAPの基質との間のインキュベーションの2分後、酵素製品は、ポータブル機器（PalmSens）数秒以内の間隔で自動的にeight測定を開始することを用いて微分パルスボルタンメトリー（DPV）によって検出されます。

Protocol

1）被覆磁気ビーズをブロッキング：

被覆磁気ビーズをブロックするために以下のように進んでください：

1. 2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブのセットを準備します。
2. （揺れがボルテックスではない）ミキサーを回転させるサンプルを用いてコーティングされた磁気ビーズを（被覆磁性ビーズの調製のための付録を参照）ホモジナイズ。
3. すぐにホモジナイズ後、ピペットそれぞれ別々のエッペンドルフチュー​​ブに被覆磁性ビーズ10μlの;
4. セットの各エッペンドルフチュー​​ブに脱脂乳ブロッキング溶液の1mlを追加します。
5. 回転サンプルミキサーに室温で30分間インキュベートした磁気ビーズを許可しなさい;
6. ソリューションブロッキング削除：2分（チューブの側壁に付着した磁性ビーズを参照）のために置くの磁気部分に磁性粒子のコンセントレータにチューブを置くそのようにして、慎重にビーズが邪魔されずに残し、上清をピペットで。
7. PBS緩衝液1ml + NaN _3を + BSA、各チューブのためのストレージソリューションとして追加します。
8. 4で被覆した、ブロックされた磁気ビーズを保存° C（被覆磁性ビーズは4℃で少なくとも2ヶ月間安定であることに注意してください）​​。

2）検量線の建設及び試料分析のための磁気ビーズで免疫チェーンは、

測定の準備ができて磁気ビーズを持っている以下のように進んでください：

1. を分析しようとしている各サンプルの抽​​出のためのコーティングとブロックされたソリューションの1つのエッペンドルフチュー​​ブ（2 ml）を取る。
2. 各ワーキング較正ソリューションのための余分なエッペンドルフチュー​​ブを取る;
3. 使用前に回転するサンプルミキサーで2分間磁性ビーズをホモジナイズ。
4. 磁性粒子の集配信装置を使用してストレージの液体を取り除く。
5. PBS / BSA洗浄液で磁気ビーズを3回洗浄する。液体洗濯取り外します。
6. 競争のステップ ：調製した抽出試料の200μlの洗浄、磁気ビーズを含む各チューブのために追加、各サンプルごとに1つの磁気ビーズチューブを使用。各標準溶液についても同じ手順を繰り返します。それぞれの磁気ビーズチューブにモノクローナル抗体溶液200μlを追加。磁気ビーズは、室温で回転するサンプルミキサーで半時間インキュベートを許可しなさい;
7. エッペンドルフチュー​​ブから競争段階に使用する溶液を除去し;
8. ラベリングのステップ：各磁気ビーズをエッペンドルフチューブに標識二次抗体の400μlを追加する。磁気ビーズは、室温で回転するサンプルミキサーで半時間インキュベートを許可しなさい;
9. エッペンドルフチュー​​ブから標識溶液を取り除く。
10. 磁気ビーズをPBS / Tweenで三回® 20洗浄液を洗浄してください。液体を取り除く。
11. DEA緩衝液100μlと磁性ビーズの各アリコートを再懸濁します。今すぐ磁気ビーズは、電気化学測定のステップの準備ができています。

マルチプレクサ（MUX）のオプションとPalmSens 3）組立

ご注意：基質加水分解の酵素製品は、電極表面を汚す、この理由のために新しい電極は、測定ごとに必要とされる。

1. シリアルケーブルを介してPalmSensにPCのラップトップを接続してください。
2. PalmSensとCH8マルチプレクサの9 - DINプラグを接続します。
3. CH8マルチプレクサ付き8チャネルマルチプレクサ電気接点のシリアルケーブルを接続します。
4. eight磁石ブロックの電極ストリップを配置。各作用電極の下にそれぞれの磁石を配置するために注意を払う（音符の、各電極のための単一の磁石の必要性は特に磁性粒子が作用電極の面積に集中されませんが必須です）。
5. 8チャンネルマルチプレクサ電気接点に電極ストリップのプラグイン;

DPV測定のために適切なボックスに次のパラメータを使用します。
E：0から始まります（V）、Eの端：0.6（V）、Eステップ：0.016（V）、Eパルス：0.0339（V）、Eコンディショニング：0（V）、Eの堆積：0（V）、スキャン速度を：0.1（V /秒）、Tパルス：0.06（秒）、Tエアコン：0（S）、T堆積：0（S）、Tの平衡：8（S）。

4）酵素反応と電気化学測定

1. 静かに磁気ビーズの十分に分散懸濁液を得るために、電気化学測定のステップの準備ができて磁気ビーズを含む各エッペンドルフチュー​​ブを振とうすることによりホモジナイズ;
2. すぐに均質化後の各エッペンドルフからピペット、、対応する作用電極の表面に磁気ビーズ分散の20μlのアリコート。つのストリップの使用の各電極​​に異なるエッペンドルフチュー​​ブ（8電極を使用する8種類のエッペンドルフ用など）から採取した磁性ビーズを20μlのための;
3. 第一の電極上に酵素基質溶液80μlを加え。 2分がカウントダウン開始。 14秒後に、第二の電極上に酵素基質溶液80μlを加える。さらに14秒後に、第三の電極に酵素基質溶液80μlを加える。同じ時間int型で進む最後の電極（14秒の間隔で基板の各アリコートを落とすことを意味する）までerval（14秒）。 14秒のインターバル時間は、測定を実行するためにポテンシオスタットが必要とする時間として計算されます。音符で、各センサーで80μlのソリューションは、作業、参照と対極をカバーする必要があります。また、各センサーのためのソリューションは、隣接する電極のソリューションと接触してはいけません。
4. 2分は、酵素基質溶液の最初の添加からカウントダウンした後、電気化学測定を開始します。
5. ソリューションごとに電流のピーク値（μA）を取得するためにPalmSens Liteソフトウェアを使用してください。

5）計算

ロジスティック4パラメータの式を用いて検量線を確立し、未知のサンプルを含む各エッペンドルフチュー​​ブ用ミリリットルあたりナノグラムのトータルHT-2/T-2毒素の量の濃度を計算する。

シグマプロット8.0を使用して実験データ、calibrants（ng / ml）の濃度に対するピーク高さ（μA）、非線形的に4パラメータロジスティック（4 - PL）式のプロット（1）（使用して装着しなければならないかカレイダグラフ）。非線形4 - PLのモデルは、通常、リガンド結合アッセイ（LBAの^）6を記述するために採用されています。

（1）
シグマプロットのカーブフィッティングプログラムによって与えられるように、B、X0、Y0はロジスティックパラメータです。
希釈されたサンプルの抽​​出液でHT-2/T-2毒素総量の含有量を計算するexplicated式を使用して、
（2）
xはmilliltreあたりナノグラム（ng / ml）の中の物流の4つのパラメータの式から計算希釈抽出液中のHT-2/T-2毒素の合計量の質量濃度、です。
yは、未知試料に対して得られたμAの電流値です

付録

6）被覆磁気ビーズ

被覆磁気ビーズを持っている以下のように進んでください：

洗浄法

1. 磁性ビーズの濃度は常に再現性を保証するために、同じである必要がある注意してくださいtosylactivated Dynabeads ®は、1分間（最大速度）しながら、ボルテックスでM - 280を（ストック溶液2 × 109ビーズ/ ml）を（発泡避ける）（ホモジナイズ測定）;
2. すぐに2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに上記の均質化ビーズを1mlのピペット。
3. 2分（チューブの側壁に付着した磁性ビーズを参照）のために置くの磁気部分に磁性粒子のコンセントレータにチューブを置きます。
4. 慎重にビーズが邪魔されずに残し、上清をピペットで。
5. 磁性粒子のコンセントレータからエッペンドルフチュー​​ブを外し、0.1 Mホウ酸バッファーpH9.5 1mlにビーズを懸濁します。 2分間回転サンプルミキサーで2分間穏やかに混ぜる。
6. 上清をピペットで。
7. エッペンドルフチュー​​ブにホウ酸緩衝液のピペット1ミリリットル。磁気ビーズは、今のコーティング工程のための準備ができています。

コーティングの手順

8. インキュベート磁気ビーズとHT - 2 - KLHのためのソリューション、KLH（キーホールリンペットヘモシアニン）磁気ビーズを1mlのストック溶液）（375 mg / mlの最終的なHT - 2 - KLH濃度）とHT - 2共役600 mlを加え20H 37℃*サンプルミキサーを回転させる上でゆっくりとチルトの回転と、
9. インキュベーションの場清オフ磁性粒子濃縮器とピペットでチューブの後に;
   PBS / BSA緩衝液1mlでコーティングされたビーズを2回洗浄する。それぞれの洗浄の間にPBS / BSA溶液を取り除く。すべての洗浄工程を5分間ミキサーを回転させることで磁気ビーズを設定し、PBS / BSA行った。
10. TRIS / BSA緩衝液1mlを用いて一度磁気ビーズを洗浄してください。 TRIS / BSA溶液を取り外します。 37℃で4時間のためにミキサーを回転させることで磁気ビーズとTRIS / BSAバッファーを設定することにより、このステップを行う° C *;
11. リフレッシュの1mlを用いて一度磁気ビーズを洗浄してください（4で冷蔵庫で保管° C）PBS / BSA緩衝液。 PBS / BSA溶液を除去。室温で5分間ミキサーを回転させることで磁気ビーズとPBS / BSAバッファーを設定するこの手順を行う。
12. ステップは、すべての洗浄液を削除し、追加の洗浄後、1mlのPBS緩衝液+ NaN _3を + BSAストレージ液として;
13. 4 ° C（被覆磁気ビーズは、4で少なくとも2ヶ月間℃で安定していることに注意してください）​​でコーティングされた磁気ビーズを格納します。

*この目的のために、ミキサーは電源供給用ケーブルを挿入できる穴を装備したオーブンに入れられます。またミキサー℃を37℃恒温室内に配置することができます

7）サンプル調製と抽出

細かく粉砕されたサンプルの25gは、（ベビーフードや朝食シリアル）我々です。ブレンダージャーにighedと高速ブレンダーで3分間、アセトニトリル/水の溶液（14分の86）の100mlで抽出した。 5分を4000 rpm（3000 G）、上清を8 mlの遠心分離がMycosepカラムで撮影し、精製した後、洗浄したエキスを4 mlを窒素気流下で乾燥させた。乾燥試料は、数ヶ月に-30℃まで保存することができます。

8）サンプルの再構成

朝食シリアル

再構成するPBS pH7.4の40mlで乾燥朝食用シリアルのエキス（穀物ベースの食品は、成人の消費に向かう）。このように仮定法的限界（200 ng / gであった）に等しい毒素の濃度のサンプルでは、​​測定ステップでの作業範囲の中央に立ち下がり信号を与える。

ベビーフード

PBS 4 mlで再構成する乾燥ベビーフード抽出物（穀物ベースの食品は、乳児の消費に向かう）。このようになっ法定上限（20〜25 ng / gであった）に等しい毒素の濃度のサンプルでは、​​測定ステップでの作業範囲の中央に立ち下がり信号を与える。

Discussion

生体分子認識プローブとしての抗体の使用は、センシング技術の普及を見ている、そのようなELISAおよびMEIAsなどの免疫化学的検出手法は、多くの研究室⁷で最も使用されると適用されるプラットフォームの間で、今日では、です。

これらのアプローチは、優れた感度と特異性を達成しながら、過去数年間で多くの研究グループの主な目的は、彼らのパフォーマンスの改善と最適化をしている。

このプロトコルでは、マイコトキシンの検出のための電気化学免疫センサを作製して調べる方法を示している。我々は、免疫ベースのセンサーを開発するために電気化学の利用が今後ますます重要であることが証明されると考えています。これは、光学個以上の電気化学的検出の固有の利点によるものです。電気化学は、実際には干渉を受けにくいですし、非特異的吸着や朝食用シリアルやbabyfoodなどの複雑なサンプルマトリックスに挑戦するときにもうまく機能に対して非常に堅牢な証明されています。また、電気化学は、微細化にとマルチ配列の適応に、より適しています。

磁性ナノ粒子とそのようなアプローチのカップリングはまた、分析性能を改善し、特に食品のサンプルに含まれる汚染物質の検出に適していることが証明されている。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P9791
Disodium hydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
MgCl2 anhydrous	Sigma-Aldrich	M8266
DEA (99.5%)	Sigma-Aldrich	31589
HCl 37%	Sigma-Aldrich	320331
H3BO3	Sigma-Aldrich	B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane	Sigma-Aldrich	252859
BSA (albumin bovine serum)	Sigma-Aldrich	A4503
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
NaN3	Aldrich	71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt	Fluka	N7255
Skimmed milk blocking solution - non fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS):	Biopure	004050	The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N'-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxin	Biopure
Magnetic beads: Dynabeads®	Invitrogen	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 109 beads/ml.
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4			Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8			Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5			Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5			Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05%			Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1%			Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02%			Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. Storage solution
Enzymatic substrate			Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution			Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution			Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution			Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions			Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH			Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody			Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step. This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody			Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S	Invitrogen
PalmSens instrument	PalmSens		Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Eight channel Mux electric contact			hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs)			hand made
Specially designed support for electrodes strip			hand made. Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes	Gilson, Inc.
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes.	Eppendorf
Falcon tubes of 5ml and 15ml.	Falcon BD
Laboratory Vortex Mixer			Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room			Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.