Summary
وصفنا بروتوكول مبسط لتوليد "فيليه" الاستعدادات للأجنة ذبابة الفاكهة من المورثات المحددة. هذا البروتوكول يسمح التنفيذ الفعال لمجموعة متنوعة من شاشات الجينية. كما يسمح التصور ممتازة الهياكل في الجنين في وقت متأخر.
Abstract
يمكن أجنة ذبابة الفاكهة بين 14 و 17 مراحل من التطور الجنيني تشريح بسهولة لتوليد "فيليه" الاستعدادات. في هذه الاستعدادات ، والنظام العصبي المركزي يعمل في منتصف أسفل ، ويحيط بها جدران الجسم. وقد تم فحص الظواهر المختلفة باستخدام العديد من هذه التحضيرات. في معظم الحالات ، كانت ولدت من قبل شرائح تشريح جسم الملطخة الأجنة كلها جبل ثابت. هذه "تشريح الثابتة" لدينا بعض العيوب ، ولكن. فهي تستغرق وقتا طويلا للتنفيذ ، وأنه من الصعب فرز متحولة (GFP سلبية) الأجنة من المخزونات التي يحتفظ بها في أكثر من طفرات الكروموسومات موازن GFP. منذ عام 2002 ، تم إجراء مجموعتنا عوز وشاشات التعبير خارج الرحم لتحديد يغاندس لمستقبلات اليتيم. طورنا من أجل القيام بذلك ، وبروتوكولات مبسطة لتشريح الجنين يعيش وتلوين الأجسام المضادة للمجموعات التي تحتوي على مئات من خطوط متوازنة. لقد استنتجنا أنه أكثر كفاءة بكثير لدراسة الظواهر في مجموعات كبيرة من الاسهم عن طريق تشريح حية من قبل تشريح الثابتة. باستخدام بروتوكول صفها هنا ، يمكن لفرد واحد المدربين الشاشة تصل إلى 10 خطا لكل يوم لمدة الظواهر ، ودراسة الأجنة 4-7 متحولة من كل سطر تحت المجهر المركب. وهذا يسمح بتحديد الطفرات منح خفية ، منخفضة انتفاذ الظواهر ، حيث يتم تسجيل ما يصل إلى 70 في كل سطر في hemisegments التكبير مع عدسة عالية للمياه الغمر 40X.
Protocol
مقدمة
يمكن أجنة ذبابة الفاكهة بين 14 و 17 مراحل من التطور الجنيني تشريح بسهولة لتوليد "فيليه" الاستعدادات. في هذه الاستعدادات ، والجهاز العصبي المركزي (CNS) يعمل باستمرار على المتوسط ، وتحيط بها جدران الجسم. تتم إزالة الأمعاء. عندما ملطخة الأضداد ، وشرائح تسمح التصور أفضل بكثير من الجهاز العصبي المركزي وهياكل جدار الجسم (المحاوير السيارات على سبيل المثال ، العضلات ، والحسية المحيطية (PNS) الخلايا العصبية ، القصبات الهوائية) ، مقارنة بما كله يشن الأجنة ، بسبب عدم وجود أنسجة الفاصلة بين إعداد و ساترة ، ولأن شرائح مسطحة ، والسماح الهياكل التي تمتد عبر جدار الجسم أن تصور في طائرة واحدة محورية. وقد تم فحص الظواهر المختلفة باستخدام العديد من هذه التحضيرات. في معظم الحالات ، يتم إنشاؤها من قبل شرائح تشريح الثابتة والأجنة كله يشن الضد الملطخة. يتم إنشاء هذه الاستعدادات التي حددها الخطوات التالية : 1) إزالة المشيماء مع التبييض ، 2) مع تثبيت بارافورمالدهيد / هيبتان ؛ تلطيخ الضد 4) باستخدام المناعية أو المناعي ؛ ؛ 3) إزالة الغشاء المحي مع الميثانول 5) المقاصة في الجلسرين ؛ 6) تشريح مع الإبر التنغستن. وتقدم بروتوكولات مفصلة لتلطيخ هذه "تشريح الثابتة" في المرجع. [1].
تشريح الثابتة وبعض العيوب ، ولكن. أولا ، غالبا ما يكون من الصعب فرز ثابتة ، متحولة الملون (GFP سلبية) الأجنة من المخزونات أو الصلبان التي هي أكثر من موازنات متوازنة الطفرات GFP ، حتى حين تستخدم لمكافحة GFP للكشف. هذا يرجع إلى مجموعة متنوعة من العوامل ، بما في ذلك التعبير الأمهات GFP. على سبيل المثال ، وجدنا أنه من المستحيل تقريبا لفرز ملون ثابت متماثل الأجنة متحولة من أسهم متوازنة كروموسوم ثالثة تستخدم إما أكتين - GFP أو المدرع (الذراع) ، GFP موازنات. الثاني ، هو تستغرق وقتا طويلا للغاية لتوليد عالية الجودة تشريح الثابتة. 10-15 في حوالي ساعة بالسرعة معظم الناس يستطيعون القيام بذلك. الثالثة ، وبعض الأجسام المضادة لا صمة جيدا في تشريح ثابتة ، إما لأن الضد الحواتم حساسة للإصلاح ، أو بسبب وجود الأجسام المضادة التي البقع هو "غارقة حتى" كل الهياكل الداخلية والخارجية من جانب الهياكل الخارجية وليس لاختراق الهياكل الداخلية ( مثل الأجسام المضادة ضد fasciclin الثالث (Fas3)). لا يمكن الرابعة ، وتلطيخ العيش مع البروتينات الانصهار مستقبلات للكشف عن التعبير يجند ينبغي القيام به على الاستعدادات الثابتة.
منذ عام 2002 ، تم إجراء مجموعتنا عوز (مدافع) وشاشات التعبير خارج الرحم لتحديد يغاندس RPTP. طورنا من أجل القيام بذلك ، وبروتوكولات مبسطة لتشريح الجنين يعيش وتلطيخ مجموعات تحتوي على مئات من خطوط متوازنة. تلطيخ ليغاندس مستقبلات اليتيم مع بروتينات مستقبلات الانصهار هو تطبيق المتخصصة التي لا تستخدمها جماعات كثيرة. ومع ذلك ، لا تستخدم العديد من المجموعات تلطيخ الضد من شرائح لتصور الظواهر الجنينية. من خلال التنمية لدينا من هذه الأساليب ، فقد استنتجنا أنه أكثر كفاءة بكثير لدراسة الظواهر في مجموعات كبيرة من الاسهم عن طريق تشريح حية من قبل تشريح الثابتة. لقد كنا نعيش تشريح لتحديد خصائص المحرك محور عصبي ، الجهاز العصبي المركزي ، والظواهر العضلات في أكثر من 600 DFS ، واتسمت أيضا الظواهر التي ينتجها الجهاز العصبي التعبير خارج الرحم أكثر من 400 سطح الخلية والبروتينات المختلفة تفرز (فصيل عبد الواحد وآخرون في إعداد ؛ هونج كونج. لام آخرون ، قيد الإعداد).
وقد تطورت البروتوكولات تشريح نحيا استخدمت على مر السنين. كان أول عرض واحد من المؤلفين (KZ) تشريح للعيش أكثر من 20 عاما من قبل Nipam باتل ، الذي كان آنذاك طالبا في الدراسات العليا في مختبر كوري غودمان. في السنوات الأخيرة ، استخدمنا هذا الأسلوب إلى وصمة عار على الجهاز العصبي المركزي مع المضادة للFas3 [2] ، ولكن تشريح الثابتة المستخدمة لجميع التجارب الأخرى. في عام 1999 ، قدم ألويزيا شميد ، ثم مرحلة ما بعد الدكتوراه في مجموعتنا ، علينا أن نعيش مع تشريح الإبر والزجاج ، والتي قالت انها تستخدم لدراسة الظواهر الذين تقطعت بهم السبل في الحمض النووي الريبي مزدوج حقن الأجنة [3 ، 4]. عندما بدأنا القيام يجند RPTP شاشات بضع سنوات في وقت لاحق ، ونحن تعديل بروتوكولات للسماح لها التحليل السريع لمجموعات كبيرة من الأسهم حافظت على موازنات GFP. وجدنا أنه يمكن GFP السلبية بسهولة من فرز الأجنة GFP متوازنة المخزونات حتى عندما يكون هناك تعبير كبير GFP الأم (مثلا موازن TM3armGFP) ، لأنه يتم فرز الأجنة يمكن أن تكون هناك اختلافات طفيفة في العيش والتعبير GFP الكشف بسهولة. يوصف الشاشة لدينا مدافع ناجحة ليجند لار في [5].
باستخدام بروتوكولات حالتنا الراهنة ، يمكن لفرد واحد المدربين خطوط الشاشة يوميا لمدة 5-10 الظواهر ، ودراسة الأجنة 4-7 متحولة من كل سطر تحت المجهر المركب. بعد اختيار وarraying الأجنة ، فإنها تأخذ حوالى ساعة واحدة لتشريح 50 الأجنة. هذا الأسلوب يتيح لنا تحديد الطفرات منح خفية ، منخفضة penetraNCE الظواهر ، لأن ما يصل الى 70 hemisegments في كل سطر وسجل ارتفاع في التكبير مع عدسة الغمر بالمياه 40X. ومثل هذه الظواهر يكون من الصعب أو المستحيل للكشف في شاشات الأجنة كله يشن ملطخة تشريح تحت المجهر.
حددت لدينا عدة مدافع لفحص المظهري الذي يحتوي على حوالي 250 خطوط ويمثل ما يقرب من نصف الجينوم (فصيل عبد الواحد وآخرون ، قيد الإعداد). وقد بدأ تطوير هذه المجموعة كجزء من الشاشة لدينا عدة مدافع بلومنغتون الذي كان قائما في الفترة 2002-2003 للجينات اللازمة لتخليق يجند RPTP [5]. في سياق هذه الشاشة ، استبدلنا بلومينغتون مجموعة DFS التي مدافع / مدافع homozygotes لم تطوير الجهاز العصبي المركزي (وبالتالي لا يمكن فرزهم للتعبير يجند CNS) مع أصغر DFS ، ويفضل تعيين جزيئيا ، التي كانت أفضل للتنمية.
مدافع / مدافع homozygotes من الأسطر في إعلامنا والفحص المظهري morphologies العام العادي في المرحلة 16 ، مما يسمح للمحقق على الشاشة بشكل منهجي عن الجينات التي تؤثر على تطور الجهاز العصبي المركزي ، والجهاز العصبي المحيطي ، وألياف العضلات ، وشبكة القصبة الهوائية ، وأنسجة أخرى كثيرة. ويمكن فحص أي هيكل ، ونمط التعبير أو التحت خلوية نمط التعريب التي visualizable مع الأجسام المضادة المحددة أو علامة GFP في مراحل ل14-16 الظواهر باستخدام هذا الطقم. هذا يعني أنه ، باستخدام بروتوكول وصفها هنا ، يمكن للمرء أن الإنفاق شخص ما يقرب من نصف قته / وقتها في هذا المشروع الشاشة بشكل منتظم من نصف جميع جينات ذبابة الفاكهة عن النمط الظاهري أي الجنينية المطلوب في غضون ستة أشهر إلى سنة واحدة.
ألف جمع ذبابة الفاكهة الجنين
1. إعداد "خمس برميل" جمع البيض الغرف
هذه الغرف توفير الوقت والجهد عند النظر في عدد كبير من خطوط الطيران.
- ترتيب five 50mL أنابيب مخروطية رأسا على عقب على الجزء السفلي من 100 × 15 مم طبق بيتري البلاستيكية والغراء والأنابيب معا باستخدام السيليكون لاصق مانع التسرب المطاطي.
- بمجرد أن يتم تصلب الغراء والصمغ الجزء السفلي من طبق بيتري على نهايات المخروطية من الأنابيب. وخمسة أنابيب مخروطية الوقوف داخل طبق بتري.
- باستخدام إبرة ساخنة ، وجعل ثقوب في أنابيب لتدوير الهواء.
2. إعداد لوحات جمع البيض
- صب حوالي 7mL من هلام آغار العنب (1 ٪) في كل 100 × 15 مم طبق بيتري البلاستيك. سمك المثالي للهلام هو حوالي 3-4 ملم لاغلاق كل أنبوب مخروطي الشكل وتوفير الرطوبة لمدة 24 ساعة. إذا كان جل سميك جدا ، فإنه قد تسقط عندما نغير اللوحة.
- بعد تهدئة لوحات هلام ، وغطاء ووضع هذه في كيس من البلاستيك الأصلي طبق بيتري. ختم الكيس بإحكام وتخزن في 4 درجات مئوية.
3. اعداد الذباب
- من أجل الحصول على ما يكفي من البيض لسهولة اختيار الأجنة في مرحلة تصحيح ، ونحن نحاول وضع> 50 العذارى الى الصليب ، جنبا إلى جنب مع الذكور 20>.
- إذا كان الصليب هو ليتم عرضه ، مزيج من الذباب الذكور والإناث ، ونضع في ذبابة القارورة الغذاء مع الكثير من حبيبات الخميرة الجافة في أسفل ورقة رقيقة الشريط (10 X 100 مم ، في نصف مطوية) مزروعة في وسط الطعام. ورقة الشريط توفير المزيد من المساحة السطحية والحفاظ على الذباب من الرطوبة الزائدة.
- الحفاظ على قارورة مع الذباب في RT لا يقل عن 3 أيام.
- إذا كانت الأسهم من الزجاجة ليتم عرضه ، ونقل ببساطة الذباب في غرفة المجموعة.
4. نقل رحلات الى خمس غرف للبرميل جمع البيض.
- تسمية كل برميل من الغرف جمع البيض.
- وضع عجينة الخميرة على بيضة لوحة جمع لكل برميل.
- إعداد 20 بوصة الشريط العلامات طويلة لاجراء الغرفة وطبق معا. طية 10 ملم في كل نهاية للتغيير لوحة سهلة.
- حقن ثاني أكسيد الكربون 2 قوارير الغاز في الطيران ونقل الذباب في برميل وصفت.
- تغطية الغرفة مع لوحة جمع البيض واضغط لأسفل.
- الشريط في جميع أنحاء الغرفة ولوحة معا بدءا من منتصف لوحة آغار. الشريط سوف تتداخل في لوحة جمع البيض.
5. جمع الأجنة
- إعداد طبق البيض جمع : وضع عجينة الخميرة على بيضة لوحة جمع لكل برميل.
- اضغط باستمرار على الذباب في غرف جمع البيض وإزالة الشريط حول غرف (امسك لوحة قديمة بإحكام).
- اضغط باستمرار على الذباب من جديد واستبدال القديم مع لوحة واحدة جديدة.
- جمع الأجنة في موقف يميل لمدة 2-4 ساعات.
- استبدال لوحة جمع البيض في الوقت المطلوب.
6. عمر الأجنة
مكان لوحة جمع البيض رأسا على عقب على طبق بيتري مغطاة الرطب 90 ملم ورقة دائرة التصفية والحفاظ على درجة الحرارة المطلوبة. لتشريح المرحلة 16 من الأجنة خطوط متحولة متوازنة ، ونحن نفعل عادة مجموعة في وقت متأخر من الصباح ، ثم احتضان للأجنةص> 22 ساعة على 19 درجة مئوية للحصول على مكاسب ، من وظيفة الدراسات باستخدام نظام UAS/GAL4 ، ونحن أجنة في جمع RT في فترة ما بعد الظهر ، واحتضان لمدة 16 ساعة عند 19 درجة مئوية. نحن اليوم التالي نقل الأجنة إلى الحاضنة 29 درجة مئوية لتنشيط نظام UAS/GAL4 : 1 أو 2 ساعة. بعد هذا القدر من الوقت ، والأجنة هي في معظمها المرحلة 15 ، وهذا يتيح وقتا كافيا لفرز الأجنة للتعبير GFP وخط لهم ، بحيث سيتم في المرحلة 16 عندما يتم تشريح.
7. التدريج والفرز الأجنة للتعبير GFP.
لتميز الأنماط الجينية للأجنة ، ونحن نستخدم GFP موازنات. ندرس الأجنة dechorionated على عصا الشريط المزدوج (انظر القسم التالي) تحت GFP أوليمبوس تشريح نطاقها ، ونختار منها بالنسبة للعمر والتعبير GFP في نفس الوقت.
أ) GFP الفرز :
- موازن كروموسوم 2 نستخدم (CyOarmGFP) قد GFP مدفوعا المروج المدرع ، وهو ما يعبر عنه في جميع أنحاء الأديم الظاهر. heterozygotes CyOarmGFP وزيتون اخضر وhomozygotes CyOarmGFP خضراء زاهية. في الأسهم CyoarmGFP ، وتتميز بسهولة الأجنة التي تفتقر إلى موازن ، لأن لديهم ما يقرب من أي تعبير GFP (أنها تبدو وكأنها أجنة من الأسهم مع أي موازن GFP).
- موازن كروموسوم 3 (TM3armGFP) من الصعب استخدامها لفرز ، لأنه أكثر أمومي مدفوعة التعبير GFP. نتيجة لذلك ، وتنقسم الى فئات الأجنة أكثر والأخضر أقل. مع بعض الممارسة ، فمن عادة بسيطة لفرز الأجنة أقل والأخضر أكثر من بعضنا البعض ، ولكن من الضروري أيضا أن تلجأ لهم بتجميعها وفتنتقي الأجنة العرضية التي هي أكثر من غيرها الخضراء (heterozygotes TM3armGFP) بعد نقل لوحة آغار. خلاف ذلك ، وهناك يقين من أن تكون بعض الأجنة التي هي من النمط الجيني غير صحيحة.
- موازن X هو FM7 KR - GAL4 ، UAS - GFP. هذا ما يعبر عنه في نمط أنسجة معينة. أنماط ذات الصلة في مراحل الفرز 15-16 هي amnioserosa ونقطتين التعبير في الرأس ، والتي هي خلايا الجهاز Bolwig ل. للأسف ، في المرحلة التي يكون فيها أحد يريد لفرز الأجنة ، وamnioserosa يتلاشى والأجهزة Bolwig أنه لم يشرع بعد في توهج. وبالتالي فمن الضروري أن ننظر بعناية شديدة في الأجنة في الشريط المتداول في كثير من الأحيان أكثر ، ليسجل لهم لGFP ، وأنه من الضروري أن تلجأ لهم على طبق آغار. عادة نفعل ذلك مرتين : مرة واحدة على الفور بعد نقل كل الأجنة من الشريط لوحة ، ومرة أخرى بعد الشيخوخة إلى مرحلة مناسبة ، قبل بطانة لهم حتى في التحضير للتشريح. في بعض الأحيان ، ونحن أيضا إعادة النظر في الشريحة ضمن نطاق GFP بعد نقل الأجنة إلى تجمع PBS (أنظر أدناه) ، وذلك لأن التصور هو أفضل من GFP ظل هذه الظروف. ثم ، يمكننا أن تدمير الأجنة التي GFP فقط قبل البدء في تشريح.
ب) التدريج
الأداة الرئيسية لتنظيم الأجنة حول الحادي والعشرين. 14-16 هو التشكل الأمعاء. يضيء الأمعاء مع تألق ذاتي ضمن نطاق GFP. قبل محاولة لأجنة المرحلة ، ينبغي للمرء أن يتشاور الكتب المرجعية أو المواقع التي تحتوي صورا ومخططات للأجنة (مثل Hartenstein وكامبوس أورتيغا الكتاب الأخضر) ، بحيث يفهمه أحد ما يجب أن تبدو. المرحلة المثالية لتشريح الأمعاء هو عندما قسمت الى ثلاث شرائح. قبل ذلك ، والقناة الهضمية يظهر على شكل فقاعة واحدة. واحد غالبا ما يفرز الأجنة في مرحلة BLOB ثم الأعمار لهم حتى يصلوا إلى مرحلة أفضل للتشريح. بعد المرحلة الثالثة الفرقة ، والأمعاء تبدأ في تطوير شرائح قطري قرب الذيل ، ثم الملفوف ، والجنين يصبح أكثر وضوحا. في غضون هذه الفترة ، فإن الجنين يصبح من الصعب تشريح لأنها لن عصا على الشريحة الزجاجية. إذا كان أحد يريد أن تشريح مرحلة متأخرة مرحلة 16/early 17 الأجنة ، فمن الضروري أن يشرح العديد من الأجنة ، والتي ترتبط تقييم morphologies الأمعاء مع الأجنة التي لا عصا عصا أو لا. هذا يختلف نوعا ما بين الأنماط الجينية كذلك.
باء ذبابة الفاكهة تشريح الجنين يعيش
- جنين dechorionation
- إعداد الوجهين شريط لاصق ولوح لوحة العنب على شريحة
- نقل الأجنة الذين تتراوح أعمارهم بين لوحة لجمع الشريط على الوجهين لزجة استخدام الفرشاة المبللة. انتشار الأجنة بالتساوي.
- Dechorionate الأجنة في الشريط على الوجهين لزجة من قبل المتداول منها عبر برفق مع إبرة تشريح اضعافها. بعد dechorionation ، فإن أجنة العصا بقوة أكبر إلى نهاية الإبرة من أن الأجنة أخرى أو إلى المشيماء ، ولكن ليس بقوة كما في الشريط ؛ بالتالي أحد الأجنة لفات على رأس المشيماء أو على أجنة أخرى ، ثم ترفع تشغيله وتحويله إلى بلاطة لوحة العنب. التنميط الجيني والتدريج (انظر أعلاه للحصول على وصف تفصيلي) ويتم ذلك من خلال عملية وdechorionationنقل إلى الإبرة.
- بعد اللجوء لالوراثي والعمر ، ونقل الأجنة إلى بلاطة مستطيلة أصغر من آغار ، من عرض كافية للسماح للاصطفاف من 10-15 الأجنة في صف واحد. محاذاة الأجنة dechorionated على هذا اللوح : الجانب الظهري انخفض مقابل ينتهي آغار بلاطة والخلفية التي تواجه نحوك. نحن عادة جعل الصفوف الأجنة 5-10.
- إعداد ونقل الأجنة الشريحة لتشريح حية
- قطع قطعة صغيرة مستطيلة من الوجهين شريط لاصق ووضعه بالقرب من شريحة واحدة من نهاية فروست / سوبر بلس (فيشر العلمية ، القط # 12-550-15).
- رسم مستطيل (30-40 ملم طويلة ، والعرض الكامل للشريحة) حول الشريط باستخدام قلم الشمع ، حتى لا يكون هناك ~ 3 ملم من مسافة بين الشمع والشريط (سوبر القلم عنق الرحم HT ، www.rpicorp. كوم ) ونقل الأجنة من بلاطة لوحة العنب إلى الشريط ، من قبل شريحة من قلب وخفض برفق على الأجنة ، بحيث الشريط يلامس الأجنة اصطف الهاتفي (المنجز في إطار نطاق تشريح). وينبغي أن تكون محاذاة الأجنة بحيث نهاية الخلفي هو نحو لك. وسوف تكون حتى الآن الجانب الظهري على الشريحة.
- إضافة على الفور 1X PBS (Gibco صفة) على أجنة لملء المستطيل الشمع.
- تشريح الجنين يعيش
- باستخدام إبرة تشريح الزجاج (مصنوعة من إبرة الحقن) ، وقطع على طول خط الوسط الظهرية ، بدءا من نهاية الخلفي من الجنين.
- كزة نهاية الأمامي من الجنين ، ارفع ونقل الجنين الى الشريحة حتى العصي. إبقاء الأجنة في المنطقة العازلة. جعل خط منظم للأجنة على الشريحة التي تتوافق مع كل صف على بلاطة آغار. تنظيم الصفوف بحيث تناسب جميع على الشريحة.
- وهناك مجموعة متنوعة من تسلسل تشريح الممكنة التي يمكن استخدامها في توليد شرائح. عادة الناس على تطوير إجراءاتها الخاصة الأمثل من خلال القيام بتشريح أنفسهم. شريط فيديو يوضح التسلسل الذي يتم إجراء قطع صغير في نهاية الخلفي للجنين للفصل بين الجانبين من جدار الجسم عن بعضها البعض. إذا رغبت في ذلك ، يمكن للمرء أيضا قطع الاتصال المعي المتوسط / المعى المؤخر مع هذا الخفض ، وتهجير من المعى المؤخر على الشريحة في هذا الوقت (في شريط الفيديو ، ويتم تشريد المعى المؤخر لاحقا). ثم ، يتم إجراء تخفيضات على كل جانب الخلفي عادل لفصوص الدماغ من أجل فصل الجدران الجسم من الدماغ. اعتمادا على عمر الجنين ، يمكن للمرء أيضا بحاجة إلى اجراء خفض الضحلة أسفل ظهري خط الوسط لقطع الاتصال بين جدران amnioserosal الجسم.
- ثم ، لصق بلطف أسفل اللوحات من جدار الجسم على الشريحة ، وتجنب شدها أو ازالة المواد من سطحها. من الأفضل القيام بذلك عن طريق السماح فقط للاتصال إبرة الزوايا الأمامية والخلفية عند حواف ظهري للجدار الجسم. لالمحاور الحركية لا تمتد حتى هذا ظهريا ، وذلك في أفضل الأحوال سوف تنتج هذا الجنين مع فروع ISN سليمة تماما. في بعض الحالات سوف يتم اقتطاعها ISN ، حتى مع أفضل تقنية ، وذلك لأن الجنين لا تفصل دائما بالضبط على طول خط الوسط الظهرية. إذا فعلت بشكل صحيح ، فإن هذا الأسلوب الحفاظ على هياكل جدار الجسم في قطاعات T3 - A6 (تقريبا).
- يمكن للمرء أن يترك المعي المتوسط على رأس الجنين ، وثم إزالته من جميع الأجنة بعد الانتهاء من تشريح جميع التشريح. يتم ذلك عن طريق بدس الأمعاء ، وشرد بعيدا عن الجنين ، وتمتد إلى انقطاع اتصاله إلى المعى الأمامي ، والتي تقع تحت فصوص الدماغ. أو ، يمكن للمرء إزالة الأمعاء من كل واحد يكمل تشريح لها. مع المسوخ التي الشاذ التنمية الأمعاء ، فإنه يعد ميزة لازالة كل الشجاعة في آن واحد بعد الانتهاء من التشريح ، وذلك لأن صفار صدر من الأمعاء يمكن أن يجعل الأمر أكثر صعوبة لأجنة العصا في وقت لاحق ، نقلت إلى الشريحة بعد نقله من الشريط doublestick . ومن المفيد في بعض الأحيان لنقل الأجنة تبدأ في الجزء السفلي من الشريحة (تجاهك) بدلا من أعلى ، ويميل إلى الصفار انتشار تجاهك بسبب حركات نموذجية من الإبرة.
- التثبيت والمناعي / المناعية
- عند هذه النقطة ، يمكن للمرء أن الإصلاح إما الأجنة على الفور ، إذا واحد هو تلطيخ مع الأضداد ، أو واحد يمكن إزالة برنامج تلفزيوني واستبدالها طاف انصهار بروتين ، إذا كان يقوم بعمل تجربة حية للكشف عن تلطيخ التعبير يجند. يتم وصف هذا الجانب من التجربة بالتفصيل في أساليب وطرق أبواب التكميلية المرجع. [5].
- نحن هنا وصف بروتوكول التثبيت ، والتي تتم إما مباشرة أو بعد تلطيخ البروتين الانصهار. باستخدام اثنين من ماصات باستور ، استبدال برنامج تلفزيوني مع بارافورمالدهيد 5 ٪ في برنامج تلفزيوني (EMS ، القط # 15713 - S ، www.emsdiasum.com). في مقابل الحل إصلاح ثلاث مرات ، والذي ينطوي على استخدام ~ 6 مل من حل الإصلاح ، منذ ماصة باستير يحمل1،5-2 مل من الحل. إصلاح 45 '.
- إزالة الإصلاح الحل ، مع استبدال برنامج تلفزيوني (3 تغييرات) ، ثم مع PBT (PBS + 0.1 ٪ تريتون X - 100 + 1 ملغ / مل الكسر الخامس BSA ؛ 3 تغييرات) ، ثم استبدل مع PBT 200 ~ حل كتلة ميكرولتر (PBT + 5 معالجة بالحرارة ٪ مصل الماعز العادي) ، ثم مع الأجسام المضادة الأساسي المطلوب في حل كتلة. من المهم جدا أن لا تسمح هلالة الاتصال الأجنة ، لا سيما أثناء وجودهم في برنامج تلفزيوني ، حيث سيؤدي ذلك إلى تدمير التشريح. بعد إضافة المنظفات الأجنة تصبح أقل حساسية لهلالة. وهكذا ، يمكن للمرء أن يحل محل PBT مع كتلة حرجة من قبل شريحة والنشاف قبالة معظم حل عن طريق لمس Kimwipe بإيجاز إلى ركن من أركان المنطقة المحاطة الشمع. ويمكن استخدام نفس الأسلوب لاستبدال كتلة الجسم مع الحل المضادة. هذه المرحل يقلل من الحلول.
- يحضن بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ، ثم يغسل 3X مع PBT (> 15 دقيقة / غسيل) في درج على منصة هزاز (تأكد من وجود ما يكفي PBT بحيث يتم دائما الشريحة مغمورة تماما خلال هزاز) ، reblock على النحو الموصوف أعلاه ، إضافة 200 الضد الثانوية ميكرولتر ، احتضان 2 ساعة. في RT ، rewash مع PBT. الاختيار تلطيخ (إذا تم استخدام مخضر) إذا رغبت في إطار GFP تشريح النطاق.
- غسل 2X مع برنامج تلفزيوني (5 ') ، ثم يضاف 500 ميكرولتر 70 ٪ glycerol/1X PBS (التي أدلى بها خلط الجلسرين 35 مل ، 5 مل 10X PBS ، و 10 مل من الماء في أنبوب 50 مل) ، واضحة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (أو لمدة 2 ساعة على RT). إزالة الجلسرين ووضع على ساترة # 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نأمل أن تكون هذه التظاهرة عرض الفيديو وأساليبنا لتشريح الجنين يعيش وتلطيخ بتفصيل كاف أنه يمكن الآن أن يتم تنفيذها بسهولة من قبل أي شخص لديه بعض الخبرة في مجال علم الوراثة وعلم الأجنة ذبابة الفاكهة. بالطبع ، لا يزال كبيرا الممارسة يكون مطلوبا ، في المقام الأول لتشريح أنفسهم. في تجربتنا ، فإن كل شخص يتعلم أساليب العيش تشريح إنشاء بروتوكول تشريح المختلفة بمهارة أن يسمح له / لها أن تولد معظم بسرعة عالية الجودة تشريح المحتشدة. هذه العملية تتطلب أشهر من أجل التنمية الكاملة. ومع ذلك ، يمكن لمعظم الناس توليد عالية الجودة تشريح بعد أسابيع قليلة من الممارسة.
على الرغم من أننا نفضل استخدام لفحص تشريح العيش ، فإنها يمكن أن تحل محل تشريح ثابتة ، لأنه لا يمكن تطبيق البروتوكولات تشريح ثابتة لمجموعة واسعة من المراحل الجنينية. على سبيل المثال ، في تحليل عدة مدافع لدينا توجيهات الظواهر الحركية محور عصبي ، وجدنا ان تفاصيل فروع محوار السيارات ، بما في ذلك أرجل كاذبة خيطية ، ويمكن تصور أفضل بكثير من قبل تلوين مناعي شرائح حية من قبل بيروكسيداز الفجل التقليدية (HRP) التصور المناعى شرائح ثابتة (للحصول على أمثلة من تلطيخ HRP عالية الجودة ، راجع التمهيدي التوجيه محوار السيارات على موقعنا مختبر صفحة الويب). ومع ذلك ، مضى عليها أكثر من الأجنة في بداية المرحلة 17 لا تتمسك SuperFrost بلس الشرائح بسبب تطويرها للبشرة. وهكذا ، على التحليل الكمي من الظواهر في وقت متأخر من لتطوير فروع محوار السيارات مثل نظام الحسابات القومية ، ونحن لا تزال تعتمد على تشريح الثابتة (AW آخرون ، قيد الإعداد).
في الوقت الحاضر ، لا تملك إلا أن هذه الأساليب المطبقة على بعض المشاكل التي مجموعتنا. وتشمل هذه تحديد وتحليل المظهري للجينات جديدة تشارك في الجهاز العصبي المركزي والمحرك محوار التوجيه ، وتحديد مستقبلات يغاندس الأيتام ، والتعرف على الجينات المطلوبة لتوليف الحواتم معترف بها من قبل MABS محددة. ومع ذلك ، يمكن تصور العديد من التطبيقات الأخرى ، وخاصة عندما يتم الجمع بين هذه الأساليب مع تحليل لعدة مدافع لدينا وجمع خارج الرحم التعبير ، أو من المجموعات الأخرى التي تم إنشاؤها بواسطة المحققين. على سبيل المثال ، ينبغي أن يكون من الممكن الشاشة بشكل منهجي عن الجينات اللازمة لتخليق الخلوية نمط التعبير ، أو في أي توطين التحت خلوية البروتين الذي يمكن اكتشافه عن طريق الأجسام المضادة عالية الجودة أو مراسل GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر نيكي فوكس وشميد ألويزيا لمساهماتها في تطوير هذه البروتوكولات. وأيد هذا العمل عن طريق منحة المعاهد الوطنية للصحة لRO1 KZ ، NS28182.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument Co. | BF120-60-10 | |
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige International | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
