Dissection en direct de Drosophile Embryons: méthodes simplifiées pour le dépistage de collections de mutants par immunofluorescence

Summary

Nous décrivons un protocole simplifié pour générer des «filets» des préparations d'embryons de drosophile de génotypes spécifiques. Ce protocole permet l'exécution efficace d'une variété d'écrans génétique. Il permet également une excellente visualisation des structures dans l'embryon en retard.

Abstract

Embryons de drosophile entre les étapes 14 et 17 du développement embryonnaire peut être facilement découpé à générer "filet" préparations. Dans ces préparations, le système nerveux central descend au milieu, et est flanqué par les parois du corps. Beaucoup de phénotypes différents ont été examinés à l'aide de ces préparations. Dans la plupart des cas, les filets ont été générés par la dissection des anticorps fixés teinté toute monture embryons. Ces «dissections fixes" ont quelques inconvénients, cependant. Ils sont longs à exécuter, et il est difficile de trier mutant (GFP-négatif) des embryons à partir des stocks dans lequel les mutations sont maintenues sur les chromosomes d'équilibrage GFP. Depuis 2002, notre groupe a effectué des carences et des écrans expression ectopique d'identifier des ligands pour les récepteurs orphelins. Pour ce faire, nous avons développé des protocoles rationalisé pour la dissection embryon vivant et coloration des anticorps de collections contenant des centaines de lignes équilibrées. Nous avons conclu qu'il est beaucoup plus efficace d'examiner les phénotypes dans les grandes collections des stocks par dissection vivre que par dissection fixe. En utilisant le protocole décrit ici, un seul individu formé peut filtrer jusqu'à 10 lignes par jour pour les phénotypes, en examinant 4-7 embryons mutants de chaque ligne sous un microscope composé. Cela permet l'identification de mutations conférant subtile, faible pénétrance phénotypes, puisque jusqu'à 70 hemisegments par ligne sont notés à fort grossissement 40X avec une immersion dans l'eau de l'objectif.

Protocol

Présentation

Embryons de drosophile entre les étapes 14 et 17 du développement embryonnaire peut être facilement découpé à générer "filet" préparations. Dans ces préparations, le système nerveux central (SNC) descend au milieu, et est flanqué par les parois du corps. L'intestin est enlevée. Lorsque colorées avec des anticorps, des filets permettent de visualiser beaucoup mieux de la CNS et structures de la paroi du corps (par exemple, les axones moteurs, les muscles, sensitive périphérique (SNP) neurones, trachées) que l'ensemble de montage des embryons, car il n'ya pas de tissu intermédiaire entre la préparation et la lamelle, et parce que les filets sont à plat, permettant aux structures qui s'étendent à travers la paroi du corps pour être visualisées dans un plan focal unique. Beaucoup de phénotypes différents ont été examinés à l'aide de ces préparations. Dans la plupart des cas, les filets sont générés par la dissection de fixe, d'anticorps teinté l'ensemble de montage embryons. Ces préparations fixes sont générés par les étapes suivantes: 1) le retrait chorion de javel; 2) de fixation au paraformaldéhyde / heptane; coloration des anticorps 4) par immunohistochimie ou immunofluorescence;; 3) l'élimination membrane vitelline avec le méthanol 5) de compensation dans le glycérol; 6) une dissection avec des aiguilles de tungstène. Des protocoles détaillés pour la coloration de ces «dissections fixe» sont fournis dans la réf. [1].

Dissections fixes ont quelques inconvénients, cependant. D'abord, il est souvent difficile de trier fixés, colorés mutant (GFP-négatif) des embryons provenant de stocks ou de croix dans lequel les mutations sont équilibrés sur les équilibreurs GFP, même quand l'anti-GFP est utilisée pour la détection. Cela est dû à une variété de facteurs, y compris l'expression maternelle de la GFP. Par exemple, nous avons constaté qu'il est presque impossible de trier fixés, colorés homozygotes embryons mutants d'être équilibré stocks troisième chromosome en utilisant soit l'actine-GFP ou le tatou (bras)-GFP équilibreurs. Deuxièmement, il est assez fastidieux pour générer de haute qualité dissections fixe. 10-15 par heure est presque aussi rapide que la plupart des gens peuvent faire cela. Troisièmement, certains anticorps ne tache pas bien dans les dissections fixe, soit parce que les épitopes des anticorps sont sensibles à corriger, ou parce que les taches d'un anticorps à la fois les structures internes et externes est «absorbé» par les structures externes et ne pénètre pas à des structures internes ( par exemple des anticorps contre le fasciclin III (Fas3)). Quatrièmement, coloration vivre avec les protéines de fusion du récepteur pour détecter l'expression du ligand peut pas être fait sur des préparations fixées.

Depuis 2002, notre groupe a effectué des carences (DF) et écrans expression ectopique d'identifier des ligands RPTP. Pour ce faire, nous avons développé des protocoles rationalisé pour la dissection embryon vivant et la coloration des collections contenant des centaines de lignes équilibrées. Coloration pour des ligands de récepteurs orphelin avec des protéines de fusion récepteur est une application spécialisée qui n'est pas employé par de nombreux groupes. Toutefois, de nombreux groupes utilisent des filets de coloration des anticorps pour visualiser phénotypes embryonnaire. Grâce à notre développement de ces méthodes, nous avons conclu qu'il est beaucoup plus efficace d'examiner les phénotypes dans les grandes collections des stocks par dissection vivre que par dissection fixe. Nous avons utilisé une dissection en direct à caractériser les axones moteurs, SNC, et les phénotypes musculaires dans plus de 600 DFS, et avons également caractérisé les phénotypes du système nerveux produites par l'expression ectopique de plus de 400 de surface des cellules différentes et des protéines sécrétées (AW et al en préparation.; HK. L. et al., en préparation).

Les protocoles de dissection en direct, nous avons utilisées ont évolué au fil des ans. Un des auteurs (KZ) a été introduit à vivre une dissection plus de 20 ans par NIPAM Patel, qui était alors un étudiant diplômé en laboratoire Corey Goodman. En plus de ces dernières années, nous avons utilisé cette méthode pour colorer le SNC avec des anti-Fas3 [2], mais employées dissections fixe pour tous les autres expériences. En 1999, Aloisia Schmid, puis un postdoc dans notre groupe, nous a présenté une dissection de vivre avec des aiguilles de verre, dont elle utilisée pour examiner les phénotypes de l'ARN double brin à injection embryons [3, 4]. Quand nous avons commencé à faire le ligand RPTP écrans quelques années plus tard, nous avons modifié son protocole pour permettre une analyse rapide de grandes collections de stocks maintenus au cours des équilibreurs GFP. Nous avons constaté que la GFP-négatif embryons peuvent être facilement triés du GFP équilibré stocks, même quand il est substantiel expression de la GFP maternelle (par exemple pour l'équilibreur TM3armGFP), car les embryons sont triés différences direct et subtil dans l'expression de la GFP peut être facilement détectée. Notre écran Df réussie pour un ligand Lar est décrit dans [5].

En utilisant nos protocoles actuels, un seul individu qualifié peut l'écran 5-10 lignes par jour pour les phénotypes, en examinant 4-7 embryons mutants de chaque ligne sous un microscope composé. Après avoir sélectionné et rangeant les embryons, il faut environ une heure pour disséquer 50 embryons. Cette méthode nous permet d'identifier des mutations conférant subtile, à faible pénétrationphénotypes nce, puisque jusqu'à 70 hemisegments par ligne sont notés à fort grossissement 40X avec une immersion dans l'eau de l'objectif. Ces phénotypes serait difficile, voire impossible à détecter dans les écrans de toute tachée de montage embryons sous un microscope à dissection.

Nous avons défini un kit de dépistage phénotypique Df qui contient environ 250 lignes et représente environ la moitié du génome (AW et al., En préparation). Le développement de ce kit a été entamé dans le cadre de notre écran du kit Bloomington Df tel qu'il existait en 2002-2003 pour les gènes nécessaires à la synthèse du ligand RPTP [5]. Au cours de cet écran, nous avons remplacé Bloomington DFS kit pour lequel Df / Df homozygotes n'ont pas développé une SNC (et donc ne pouvait pas être projeté pour le ligand d'expression SNC) avec de petites DFS, de préférence moléculairement cartographié, qui avait un meilleur développement.

Df / Df homozygotes à partir de lignes dans notre trousse de dépistage phénotypique normale ont des morphologies globale au stade 16, permettant à un enquêteur de l'écran systématiquement pour les gènes affectant le développement du SNC, le SNP, les fibres musculaires, le réseau de la trachée et de nombreux autres tissus. Toute la structure, le modèle d'expression, ou un motif de localisation subcellulaire qui est visualisable avec un anticorps spécifique ou un marqueur GFP à des stades de 14 à 16 peuvent être sélectionnés pour les phénotypes en utilisant ce kit. Cela signifie que, en utilisant le protocole décrit ici, on dépense environ la moitié des personnes de son / ses temps sur ce projet pourrait systématiquement l'écran de la moitié des gènes de drosophile pour tout phénotype souhaité embryonnaire dans les six mois à un an.

Collection A. embryon de drosophile

1. Préparer «Cinq-Barrel" chambres de collecte d'œufs

Ces chambres économiser temps et effort lors de l'examen d'un grand nombre de lignes de voler.

1. Organiser cinq tubes coniques de 50 ml à l'envers sur une partie inférieure d'un 100 x 15 mm boîte de Petri en plastique et coller les tubes ensemble en utilisant le silicium mastic adhésif caoutchouc.
2. Une fois la colle durcie, la colle la partie inférieure de la boîte de Pétri sur les extrémités des tubes coniques. Cinq tubes coniques se tenir à l'intérieur de la boîte de Petri.
3. En utilisant une aiguille chaude, faire des trous dans les tubes de circulation d'air.

2. Préparer les plaques collecte des œufs

1. Verser environ 7 ml de gélose de raisin (1%) dans chacune de 100 x 15 mm boîte de Petri en plastique. L'épaisseur idéale du gel est d'environ 3-4 mm pour sceller chaque tube conique et de fournir l'humidité pendant 24 heures. Si le gel est trop épais, il risque de tomber quand nous changeons l'assiette.
2. Après refroidir les plaques au gel, couvrir et mettre ces mets dans le sac en plastique d'origine de Pétri. Sceller le sac hermétiquement et conserver à 4 ° C.

3. Préparer des mouches

1. Afin d'obtenir suffisamment d'oeufs pour une sélection facile des embryons de stade approprié, nous essayons de mettre> 50 vierges en croix, avec> 20 mâles.
2. Si une croix est d'être projeté, mélanger les mouches mâles et femelles et les conserver dans un flacon alimentaires voler avec beaucoup de boulettes de levure sèche sur le fond et une bande de papier mince (10 x 100 mm, plié en deux) planté au milieu du la nourriture. La bande de papier va offrir plus de surface et de garder les mouches de l'humidité excessive.
3. Conserver les flacons avec des mouches à température ambiante pendant au moins 3 jours.
4. Si un stock d'une bouteille est d'être projeté, il suffit de transférer les mouches dans la chambre de collecte.

4. Transfert des mouches à cinq le baril chambres de collecte d'œufs.

1. Étiquette du baril chacune des chambres de collecte d'œufs.
2. Mettez la pâte sur une plaque de levure de collecte des œufs pour chaque baril.
3. Préparer 20 pouces étiquetage bandes longues pour maintenir la chambre et la plaque ensemble. Pliez 10 mm de chaque extrémité pour changer de plaque facile.
4. Injecter le CO ₂ de gaz dans les flacons voler et transférer les mouches dans les barils étiquetés.
5. Couvrir la chambre avec la plaque de collecte des œufs et appuyez vers le bas.
6. Bande autour de la chambre et la plaque ainsi à partir du milieu de la plaque de gélose. La bande se chevauchent sur la plaque de collecte des œufs.

5. Recueillir des embryons

1. Préparer la plaque collecte des œufs: Mettez la pâte sur une plaque de levure de collecte des œufs pour chaque baril.
2. Tap bas les mouches dans les chambres de collecte d'œufs et enlever le ruban autour des chambres (Maintenez la plaque ancienne serré).
3. Tap bas de la vole à nouveau et remplacer la plaque ancienne avec une nouvelle.
4. Recueillir des embryons en position inclinée pendant 2-4 heures.
5. Remplacer la plaque collecte des œufs au moment désiré.

6. Embryons Âge

Placer la plaque collecte des œufs à l'envers sur une plaque recouverte de Pétri humide du papier 90 mm Filtre cercle et de garder à la température désirée. Pour les dissections de l'étape 16 embryons à partir équilibrée lignées mutantes, nous font généralement une collection en fin de matinée, puis incuber les embryons à des finsr> 22 h à 19 ° C. Pour le gain de fonction des études utilisant le système UAS/GAL4, nous recueillons des embryons à TA dans l'après-midi et incuber pendant 16 heures à 19 ° C. Le lendemain, nous transférons les embryons d'un incubateur à 29 ° C pour activer le système UAS/GAL4 pour 1 ou 2 heures. Après ce laps de temps, les embryons sont souvent l'étape 15, ce qui permet de suffisamment de temps pour trier les embryons pour expression de la GFP et de les aligner, alors qu'ils seront au stade de 16 lors de la dissection est faite.

7. Staging des embryons et de tri pour expression de la GFP.

Pour discriminer les génotypes des embryons, nous utilisons les équilibreurs GFP. Nous examinons embryons dechorionated sur le double bâton de bande (voir la section suivante), sous une GFP Olympus dissection étendue, et nous les sélectionner pour l'âge et expression de la GFP dans le même temps.

a) la GFP de tri:

1. L'équilibreur de chromosomes 2è WE utilisation (CyOarmGFP) a GFP conduit par le promoteur tatou, qui est exprimée à travers l'ectoderme. Hétérozygotes CyOarmGFP sont vert olive, et les homozygotes CyOarmGFP sont vert clair. Dans un stock CyoarmGFP, les embryons qui n'ont pas l'équilibreur sont faciles à distinguer, car ils n'ont pratiquement aucune expression de la GFP (ils ressemblent à des embryons à partir d'un stock sans équilibrage GFP).
2. L'équilibreur de chromosomes 3ème (TM3armGFP) est plus difficile à utiliser pour le tri, car il a plus d'expression de la GFP mère entraînée. En conséquence, les embryons sont divisés en catégories plus ou moins vertes. Avec un peu de pratique, il est habituellement facile de trier les embryons moins et plus verts les uns des autres, mais il est également nécessaire pour assurer leur station en leur regroupement et la cueillette sur les embryons occasionnels qui sont plus verts que les autres (hétérozygotes TM3armGFP) après le transfert à la plaque de gélose. Sinon, il ya sûr d'être certains embryons qui sont du génotype incorrecte.
3. L'équilibreur de X est FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Cela est exprimé dans un modèle spécifique au tissu. Les modèles qui sont pertinents pour le tri à des stades 15-16 sont l'amnioserosa et deux points de l'expression dans la tête, qui sont des cellules d'orgue de la Bolwig est. Malheureusement, au stade où l'on veut pour trier les embryons, l'amnioserosa s'estompe et les organes de l'Bolwig n'ont pas encore commencé à briller. Il est donc nécessaire d'examiner très soigneusement les embryons sur la bande, souvent les rouler, de les marquer pour la GFP, et il est essentiel de les station sur la plaque de gélose. Habituellement nous faisons ceci deux fois: immédiatement après le déplacement de tous les embryons de la bande à la plaque, et de nouveau après un vieillissement à l'étape appropriée, juste avant de les aligner en préparation pour la dissection. Parfois, nous avons également réexaminer la glisser sous le champ GFP après le transfert des embryons à la piscine du PBS (voir ci-dessous), parce que la visualisation de la GFP est préférable dans ces conditions. Ensuite, nous pouvons détruire des embryons qui ont GFP juste avant le début de la dissection.

b) Mise en scène

L'outil principal de mise en scène autour de St embryons. 14-16 est la morphologie intestinale. Le témoin intestin avec autofluorescence sous le coup GFP. Avant d'essayer de embryons au stade, on devrait consulter des livres de référence ou des sites qui ont des photos et des schémas d'embryons (par exemple le Hartenstein et Campos-Ortega livre vert), de sorte que l'on comprend ce qu'ils devraient ressembler. L'étape idéale pour la dissection, c'est quand l'intestin est divisé en trois bandes. Avant cela, l'intestin apparaît comme une tache unique. On a souvent des embryons au stade sortes blob et puis les âges jusqu'à ce qu'ils atteignent la meilleure scène pour la dissection. Après l'étape à trois bandes, l'intestin commence à se développer des bandes diagonales près de la queue, puis les bobines, et l'embryon devient plus claire. Durant cette période, l'embryon devient difficile de disséquer, car elle ne colle pas sur la lame de verre. Si l'on veut décortiquer stade tardif 16/early stade de 17 embryons, il est nécessaire de disséquer plusieurs embryons et d'évaluer ce qui morphologies intestin sont associées avec des embryons qui collent ou ne collent pas. Cela varie quelque peu entre les génotypes ainsi.

Dissection B. drosophile embryon vivant

1. Dechorionation Embryon
   1. Préparer un adhésif double face collante et la dalle de la plaque de raisin sur une diapositive
   2. Transfert des embryons âgés de la plaque de collection à l'adhésif double face collante à l'aide d'un pinceau mouillé. Fais embryons uniformément.
   3. Dechorionate les embryons sur le ruban à double face collante en les roulant doucement à travers elle avec une aiguille émoussée dissection. Après dechorionation, les embryons se tenir plus fortement à la fin de l'aiguille que pour d'autres embryons ou pour le chorion, mais pas aussi fortement que sur la bande; donc on roule les embryons sur le dessus du chorion ou sur d'autres embryons, puis soulève c'est hors et le transfère à la dalle de la plaque de raisin. Génotypage et mise en scène (voir ci-dessus pour une description détaillée) se fait durant le processus de dechorionation ettransfert à l'aiguille.
   4. Après avoir recours pour le génotype et l'âge, de déplacer les embryons à un plus petit dalle rectangulaire d'agar, d'une largeur suffisante pour permettre à la queue de 10-15 embryons dans une rangée. Alignez les embryons dechorionated sur cette dalle: face dorsale vers le bas contre les extrémités agar dalle et postérieure vers vous. Normalement, nous font rangées d'embryons 5-10.
2. Préparer un toboggan et le transfert des embryons pour la dissection en direct
   1. Coupez un petit morceau rectangulaire de ruban adhésif double face collante et le placer près d'une extrémité de Super Frost / glisser plus (Fisher Scientific, Cat # 12-550-15).
   2. Dessinez un rectangle (30-40 mm de long, et la largeur de la diapositive) autour de la bande avec un crayon de cire, de sorte qu'il ya ~ 3 mm d'espace entre la cire et du ruban adhésif (Super Pen Pap HT, www.rpicorp. com ) et de transférer les embryons de la dalle de la plaque de raisin sur la bande, en inversant la lame et l'abaissant doucement sur ​​les embryons, de sorte que la bande est en contact avec les embryons alignés vers le haut (fait sous un microscope à dissection). Les embryons doivent être alignés de telle sorte que l'extrémité postérieure est vers vous. Ils seront désormais en place face dorsale de la diapositive.
   3. Immédiatement ajouter du PBS 1X (recette Gibco) sur les embryons pour remplir le rectangle de cire.
3. Dissection embryon vivant
   1. En utilisant une aiguille de dissection de verre (fait à partir d'une aiguille d'injection), couper le long de la ligne médiane dorsale, à partir de l'extrémité postérieure de l'embryon.
   2. Poke l'extrémité antérieure de l'embryon, soulever et transférer l'embryon à la diapositive jusqu'à ce qu'elle colle. Gardez embryons dans le buffer. Faire une ligne ordonnée des embryons sur la diapositive qui correspond chaque ligne sur la dalle de gélose. Organiser les lignes de sorte qu'ils seront tous tenir sur la diapositive.
   3. Il existe une variété de séquences de dissection possibles qui peuvent être utilisés pour générer les filets. Les gens en général de développer leurs propres procédures optimisées par la pratique des dissections eux-mêmes. La vidéo démontre une séquence dans laquelle une petite incision est faite à l'extrémité postérieure de l'embryon pour séparer les deux côtés de la paroi du corps de l'autre. Si désiré, on peut aussi rompre la connexion intestin moyen / hindgut avec cette coupe, et déplacer l'intestin postérieur à sur la lame en ce moment (dans la vidéo, le déplacement se fait hindgut plus tard). Ensuite, les coupures sont faites sur chaque côté juste derrière les lobes du cerveau afin de séparer les parois du corps par le cerveau. Selon l'âge de l'embryon, on peut aussi besoin de faire une coupe peu profonde bas de la ligne médiane dorsale de couper les liens entre les murs amnioserosal corps.
   4. Puis, doucement la pâte les rabats de la paroi du corps sur la lame, en évitant les étirements ou retirer le revêtement de leur surface. Le mieux est en autorisant seulement l'aiguille de contacter les coins antérieures et postérieures à la périphérie dorsale de la paroi du corps. Les axones moteurs ne s'étendent pas aussi loin dorsalement, donc dans le meilleur des cas cela va produire un embryon avec des branches ISN complètement intacte. Dans certains cas, l'ISN sera tronquée, même avec la meilleure technique, parce que l'embryon n'est pas toujours séparés exactement le long de la ligne médiane dorsale. Si fait correctement, cette méthode permettra de préserver les structures paroi du corps dans des segments de T3-A6 (environ).
   5. On peut partir de l'intestin moyen sur le dessus de l'embryon, puis retirez-le de tous les embryons disséqués après avoir terminé toutes les dissections. Cela se fait en poussant l'intestin, le déplaçant loin de l'embryon, et elle s'étend à briser son lien avec l'intestin antérieur, qui se trouve sous les lobes du cerveau. Ou encore, on peut enlever l'intestin de chaque dissection comme on le termine. Avec le développement des mutants qui ont intestinale anormale, c'est un avantage de supprimer tous les tripes à la fois après avoir terminé les dissections, car le jaune libéré de l'intestin peut rendre plus difficile de s'en tenir embryons transférés plus tard à la diapositive après le transfert de la bande doublestick . Il est parfois utile de transférer les embryons à partir de la partie inférieure de la diapositive (vers vous) plutôt que dans la partie supérieure, comme le jaune a tendance à s'étendre vers vous en raison des mouvements typiques de l'aiguille.
4. Fixation et immunofluorescence / immunohistochimie
   1. À ce stade, on peut soit fixer les embryons immédiatement, si l'on n'est coloration avec des anticorps, ou l'on peut retirer le CPE et le remplacer par surnageant protéine de fusion, si l'on fait vivre une expérience coloration pour détecter l'expression du ligand. Cet aspect de l'expérience est décrite en détail dans les méthodes et les méthodes complémentaires des sections de réf. [5].
   2. Nous décrivons ici le protocole de fixation, ce qui se fait soit immédiatement, soit après coloration des protéines de fusion. L'utilisation de deux pipettes Pasteur, remplacer le PBS avec 5% de paraformaldéhyde dans du PBS (EMS, Cat. # 15713-S, www.emsdiasum.com). Bourse de fixer dans une solution à trois reprises, ce qui implique l'utilisation de ~ 6 ml de solution de fixer, puisque d'une pipette Pasteur détient1,5 à 2 ml de solution. Correction pour les 45 '.
   3. Retirer corriger solution, remplacer par du PBS (3 changements), puis avec PBT (PBS + 0,1% de Triton X-100 + 1 mg / ml BSA Fraction V, 3 changements), puis remplacer PBT avec ~ 200 solution de bloc ul (PBT + 5 traités thermiquement% de sérum de chèvre normal), puis avec l'anticorps souhaité primaires en solution bloc. Il est très important de ne pas permettre le ménisque de contacter les embryons, en particulier alors qu'ils sont dans le PBS, car cela détruirait les dissections. Après détergent est ajouté les embryons deviennent moins sensibles au ménisque. Ainsi, on peut remplacer le PBT avec bloc en inclinant la lame et le buvard pied la plupart de la solution en touchant un Kimwipe brièvement à l'angle de la surface délimitée par la cire. La même méthode peut être utilisée pour remplacer le bloc avec une solution anti-corps. Ce report minimise de solutions.
   4. Incuber une nuit à 4 ° C, puis lavez-3X avec PBT (> 15 minutes / lavage) dans un plateau sur un plateau oscillant (s'assurer qu'il ya assez de PBT sorte que la lame est toujours complètement immergé pendant bascule), boucher à comme décrit précédemment, Ajouter 200 ul d'anticorps secondaires, incuber 2 heures. à TA, relaver avec PBT. Vérifiez coloration (si la fluorescence verte est utilisée) si désiré sous la GFP dissection étendue.
   5. Laver avec du PBS 2X (5 '), puis ajouter 500 ul de 70% glycerol/1X PBS (fabriqué en mélangeant 35 ml de glycérol, 5 ml PBS 10X, et 10 ml d'eau dans un tube de 50 ml), et clair la nuit à 4 ° C (ou pendant 2 heures à température ambiante). Retirer du glycérol et de mettre sur un n ° 1 lamelle.

Discussion

Nous espérons que cette vidéo de démonstration a affiché nos méthodes pour la dissection embryon vivant et coloration avec suffisamment de détails qu'ils peuvent maintenant être facilement exécutées par toute personne qui a une certaine expérience de la drosophile génétique et en embryologie. Bien sûr, la pratique considérable sera toujours nécessaire, surtout pour les dissections eux-mêmes. Dans notre expérience, toute personne qui apprend les méthodes de dissection direct va créer un protocole de dissection subtilement différente qui permet lui / elle pour générer rapidement les plus de haute qualité dissections vêtu. Ce processus exige des mois de développement complet. Cependant, la plupart des gens peuvent générer de haute qualité dissections après quelques semaines de pratique.

Bien que nous privilégions l'utilisation de dissections direct pour le dépistage, ils ne peuvent pas remplacer les dissections fixe, parce que les protocoles de dissection fixe peut être appliquée à un large éventail des stades embryonnaires. Par exemple, dans l'analyse de notre kit de Df des phénotypes moteur guidage axonal, nous avons constaté que les détails de branches axone moteur, y compris les filopodes, peut être beaucoup mieux visualisés par immunofluorescence de filets de vivre que par la peroxydase de raifort classiques (HRP) visualisation immunohistochimique des filets fixes (pour des exemples de haute qualité coloration HRP, voir l'amorce de guidage des axones moteurs sur notre page web du laboratoire). Cependant, les embryons plus âgés que le début de l'étape 17 ne colle pas à Superfrost Plus diapositives en raison de leur développement de la cuticule. Ainsi, pour l'analyse quantitative des phénotypes pour la fin-développement branches axone moteur tels que le SCN, nous comptent encore sur les dissections fixe (AW et al., En préparation).

A l'heure actuelle, ces méthodes ne sont appliquées à quelques problèmes par notre groupe. Il s'agit notamment de l'identification et l'analyse phénotypique de nouveaux gènes impliqués dans le SNC et des axones moteurs orientation, l'identification de ligands de récepteurs orphelins, et l'identification des gènes nécessaires à la synthèse des épitopes reconnus par des anticorps monoclonaux spécifiques. Cependant, de nombreuses autres applications peuvent être envisagées, en particulier lorsque ces méthodes sont combinées avec l'analyse de notre kit de Df et la collecte de l'expression ectopique, ou des collections générées par d'autres enquêteurs. Par exemple, il devrait être possible de dépister systématiquement les gènes nécessaires à la synthèse, le modèle d'expression cellulaire, ou la localisation subcellulaire de toute protéine qui peut être détectée par un anticorps de haute qualité ou un rapporteur GFP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate Tubing With Filament	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Narishige model PC-10 needle puller	Narishige International		Tubes pulled using a heater level of 58.9