La disección en vivo de Drosophila Los embriones: métodos simplificados para la detección colecciones mutantes tinción con anticuerpos

Summary

Se describe un protocolo eficiente para la generación de "filete" los preparativos de los embriones de Drosophila de genotipos específicos. Este protocolo permite la ejecución eficiente de una variedad de exámenes genéticos. También permite una excelente visualización de las estructuras en el embrión tarde.

Abstract

Embriones de Drosophila entre las etapas 14 y 17 del desarrollo embrionario puede ser fácilmente disecado para generar "filete" los preparativos. En estos preparativos, el sistema nervioso central baja por la mitad, y está flanqueado por las paredes del cuerpo. Muchos diferentes fenotipos han sido examinadas con estos preparados. En la mayoría de los casos, los filetes se han generado por la disección de anticuerpo teñido de montaje fijo de todo el embrión. Estos "disecciones fijos" tienen algunas desventajas, sin embargo. Ellos llevan mucho tiempo en ejecutarse, y es difícil de clasificar mutante (GFP-negativos), los embriones de las existencias en los que las mutaciones se mantienen en el equilibrio de los cromosomas GFP. Desde 2002, nuestro grupo ha llevado a cabo la deficiencia y las pantallas ectópico expresión para identificar ligandos para los receptores huérfanos. Con el fin de hacer esto, hemos desarrollado protocolos simplificados para la disección de embriones vivos y la tinción de anticuerpos de las colecciones que contienen cientos de líneas equilibradas. Hemos concluido que es mucho más eficiente para examinar los fenotipos de las grandes colecciones de las reservas mediante la disección en vivo de la disección fijo. Utilizando el protocolo descrito aquí, una persona capacitada solo pueden detectar hasta 10 líneas por cada día de fenotipos, el examen de 4-7 embriones mutantes de cada línea con un microscopio compuesto. Esto permite la identificación de mutaciones que confieren sutil, de baja penetrancia fenotipos, ya que el 70 hemisegments por línea se anotan al gran aumento de 40X con una lente de inmersión en agua.

Protocol

Introducción

Embriones de Drosophila entre las etapas 14 y 17 del desarrollo embrionario puede ser fácilmente disecado para generar "filete" los preparativos. En estos preparativos, el sistema nervioso central (SNC) se ejecuta en el medio, y está flanqueado por las paredes del cuerpo. El intestino es eliminado. Cuando se tiñen con anticuerpos, los filetes de permitir la visualización mucho mejor del sistema nervioso central y las estructuras del cuerpo de la pared (por ejemplo, los axones de motor, los músculos, sensorial periférica (PNS), las neuronas, tráqueas) que hacer todo el montaje embriones, porque no hay tejido intermedio entre la preparación y la cubreobjetos, y porque los filetes son planas, permitiendo que las estructuras que se extienden por la pared del cuerpo para ser visualizados en un plano focal. Muchos diferentes fenotipos han sido examinadas con estos preparados. En la mayoría de los casos, los filetes son generados por la disección de los equipos fijos de anticuerpos teñidos de montaje de todo el embrión. Estas preparaciones fijas son generados por los siguientes pasos: 1) la eliminación del corion con cloro, 2) la fijación con paraformaldehído / heptano, la tinción de anticuerpos 4) mediante inmunohistoquímica o inmunofluorescencia, y 3) eliminación de la membrana vitelina con metanol 5) claro en glicerol; 6) la disección con las agujas de tungsteno. Protocolos detallados para la tinción de estos "disecciones fija" se proporcionan en la ref. [1].

Disecciones fijos tienen algunas desventajas, sin embargo. En primer lugar, a menudo es difícil de clasificar fijo, manchada mutante (GFP-negativos), los embriones de las existencias o cruces en las que las mutaciones son equilibradas a lo largo balanceadores de las buenas prácticas agrarias, aun cuando el anti-GFP se utiliza para la detección. Esto se debe a una variedad de factores, incluyendo la expresión maternal de las buenas prácticas agrarias. Por ejemplo, hemos encontrado que es casi imposible de clasificar fijo, manchado embriones mutantes homocigotos de acciones equilibradas tercer cromosoma utilizando actina-GFP o armadillo (brazo)-GFP balanceadores. En segundo lugar, es bastante tiempo para generar alta calidad disecciones fijo. 10.15 por hora es casi tan rápido como la mayoría de la gente puede hacer esto. En tercer lugar, algunos anticuerpos no se manchan y en las disecciones fijo, ya sea porque los epítopos anticuerpos son sensibles a la solución, o por un anticuerpo que las manchas de ambas estructuras internas y externas es "absorbido" por las estructuras externas y no penetrar en las estructuras internas ( por ejemplo, anticuerpos contra fasciclin III (FAS3)). Tinción en cuarto lugar, vivir con las proteínas de fusión del receptor para detectar la expresión del ligando no se puede hacer sobre los preparativos fijo.

Desde 2002, nuestro grupo ha llevado a cabo la deficiencia (DF) y pantallas ectópico expresión para identificar ligandos RPTP. Con el fin de hacer esto, hemos desarrollado protocolos simplificados para la disección de embriones vivos y la tinción de las colecciones que contienen cientos de líneas equilibradas. La tinción de ligandos del receptor huérfano con las proteínas de fusión del receptor es una aplicación especializada que no es empleado por muchos grupos. Sin embargo, muchos grupos hacen uso de la tinción de anticuerpos de los filetes de visualizar los fenotipos de embriones. A través de nuestro desarrollo de estos métodos, hemos concluido que es mucho más eficiente para examinar los fenotipos de las grandes colecciones de las reservas mediante la disección en vivo de la disección fijo. Hemos utilizado la disección en vivo para caracterizar axón motor, sistema nervioso central, y los fenotipos de los músculos en más de 600 DFS, y también se han caracterizado los fenotipos del sistema nervioso producida por la expresión ectópica de más de 400 superficie de células y proteínas secretadas (AW et al, en preparación.; HK. L. et al., en preparación).

Los protocolos de la disección en vivo que hemos utilizado han evolucionado a lo largo de los años. Uno de los autores (KZ) fue introducido por primera vez a vivir la disección de más de 20 años por Nipam Patel, quien era entonces un estudiante graduado en el laboratorio de Corey Goodman. En los últimos años, hemos utilizado este método para teñir el SNC con anticuerpos anti-FAS3 [2], sino que emplea la disección fija para todos los otros experimentos. En 1999, Aloisia Schmid, entonces un postdoctorado en nuestro grupo, nos presentó a vivir la disección con agujas de cristal, que se utiliza para examinar los fenotipos de ARN de doble cadena de inyección de embriones [3, 4]. Cuando empezamos a hacer el ligando RPTP pantallas de unos pocos años más tarde, modificó su protocolo para permitir un rápido análisis de grandes colecciones de reservas mantenidas sobre los equilibradores de las buenas prácticas agrarias. Hemos encontrado que las buenas prácticas agrarias-negativos embriones pueden ser fácilmente ordenados a partir de buenas prácticas agrarias de las poblaciones de equilibrio, incluso cuando no es la expresión de GFP sustancial materna (por ejemplo, para el equilibrador de TM3armGFP), porque los embriones son ordenados en vivo y las diferencias sutiles en la expresión de GFP se puede detectar fácilmente. Nuestra pantalla Df éxito de un ligando Lar se describe en [5].

Utilizando los protocolos actuales, una persona capacitada solo pueden detectar líneas 5.10 por día para los fenotipos, el examen de 4-7 embriones mutantes de cada línea con un microscopio compuesto. Después de seleccionar y formar arreglos de los embriones, que dura aproximadamente una hora de diseccionar 50 embriones. Este método nos permite identificar las mutaciones que confieren sutil, de baja penetraciónna vez que fenotipos, ya que el 70 hemisegments por línea se anotan al gran aumento de 40X con una lente de inmersión en agua. Fenotipos sería difícil o imposible de detectar en las pantallas de todo el montaje manchadas embriones bajo un microscopio de disección.

Hemos definido un kit para la detección fenotípica Df que contiene alrededor de 250 líneas y representa aproximadamente la mitad del genoma (AW et al., En preparación). El desarrollo de este kit se inició como parte de nuestra pantalla del kit de Bloomington Df, tal como existía en el período 2002-2003 de los genes necesarios para la síntesis de ligandos RPTP [5]. En el curso de esta pantalla, que sustituye Bloomington DFS kit para el que Df / Df homocigotos no se desarrolló un sistema nervioso central (y por lo tanto no podían ser examinados para la expresión del ligando del SNC) y en menor DFS, preferiblemente molecularmente asignada, que tenía un mejor desarrollo.

DF / DF homocigotos de las líneas en nuestro kit de detección fenotípica han normal morfología general en la etapa 16, lo que permite a un investigador a la pantalla de forma sistemática por los genes que afectan el desarrollo del SNC, SNP, las fibras musculares, la red de la tráquea, y muchos otros tejidos. Cualquier estructura, patrón de expresión, o el patrón de localización subcelular que es visualizable con un anticuerpo específico o marcador GFP en las etapas 14 a 16 pueden ser examinados para los fenotipos de usar este kit. Esto significa que, utilizando el protocolo descrito aquí, un gasto por persona alrededor de la mitad de su / su tiempo en este proyecto de manera sistemática podría pantalla de la mitad de los genes de Drosophila para cualquier fenotipo deseado embrión dentro de seis meses a un año.

A. Drosophila de recogida de embriones

1. Prepare "Five-Barril" cámaras de recolección de huevos

Estas cámaras de ahorrar tiempo y esfuerzo al examinar un gran número de líneas de mosca.

1. Organizar cinco tubos cónicos de 50 ml al revés en una parte inferior de 100 x 15 mm plato Petri de plástico y los tubos de pegamento, junto con goma de silicona sellante adhesivo.
2. Una vez que el pegamento se endurece, la cola de la parte inferior de la placa de Petri en los extremos de los tubos cónicos. Cinco tubos cónicos se mantendrá dentro de la placa de Petri.
3. Usando una aguja caliente, hacer agujeros en los tubos de ventilación.

2. Preparar las placas de recolección de huevos

1. Vierta aproximadamente 7 ml de gel de agar de uva (1%) en cada uno de 100 x 15 mm plato de plástico Petri. El grosor ideal del gel es de unos 3-4 mm para sellar cada tubo cónico y para proporcionar la humedad por 24 horas. Si el gel es demasiado espesa, se puede caer cuando se cambia la placa.
2. Después de enfriar las placas con gel, la cubierta y se meten en la bolsa de plástico original plato de Petri. Cierre la bolsa herméticamente y se almacenan a 4 ° C.

3. Prepare las moscas

1. Con el fin de obtener suficientes óvulos para facilitar la selección de embriones de la etapa correcta, tratamos de poner> 50 vírgenes en una cruz, junto con> 20 varones.
2. Si se hace una cruz que se proyectarán, mezclar las moscas macho y hembra y guardar en un frasco de comida volar con un montón de pastillas de levadura seca en la parte inferior y una tira de papel delgado (10 x 100 mm, doblado por la mitad) plantado en el centro de los alimentos. La tira de papel que ofrecen una mayor superficie y mantener a las moscas de la humedad excesiva.
3. Conservar los viales con las moscas a temperatura ambiente durante al menos 3 días.
4. Si una acción de una botella es de hacerlos, simplemente la transferencia de las moscas en la cámara de recolección.

4. Transferencia vuela a cinco barriles cámaras recolección de huevos.

1. La etiqueta del barril cada uno de los cámaras de la recolección de huevos.
2. Ponga pasta de levadura en una placa de recolección de huevos por cada barril.
3. Prepare 20 pulgadas de cinta de etiquetado de largo para sostener la cámara y la placa juntos. Pliegue de 10 mm de cada extremo de la placa de cambio fácil.
4. Inyectar gas CO ₂ en los viales de la mosca y la transferencia de las moscas en los barriles marcados.
5. Cubrir la cámara con la placa de la recolección de huevos y presione hacia abajo.
6. Cinta métrica alrededor de la cámara y la placa junto a partir de la mitad de la placa de agar. La cinta se superponen en la placa de la recolección de huevos.

5. Recoger los embriones

1. Prepare la placa de recolección de huevos: Poner pasta de levadura en una placa de recolección de huevos por cada barril.
2. Toque por las moscas en las cámaras de recolección de huevos y quitar la cinta adhesiva alrededor de las cámaras (Sostenga la placa vieja fuerte).
3. Toque por la vuela de nuevo y vuelva a colocar la placa antigua por una nueva.
4. Recoger embriones en posición inclinada durante 2-4 horas.
5. Vuelva a colocar la placa de la recolección de huevos en el momento deseado.

6. Embriones edad

Coloque la placa de la recolección de huevos al revés sobre una placa de Petri cubiertas con papel húmedo 90 mm círculo de filtro y mantener a la temperatura deseada. Para la disección de la etapa 16 embriones a partir de equilibrado de líneas mutantes, por lo general hacer una colección en la final de la mañana, luego incubar los embriones parar> 22 horas a 19 ° C. Para los estudios de ganancia de función mediante el sistema de UAS/GAL4, recogemos los embriones a temperatura ambiente en la tarde y se incuba durante 16 horas a 19 ° C. Al día siguiente nos trasladamos a los embriones a una incubadora de 29 ° C para activar el sistema UAS/GAL4 para 1 o 2 horas. Después de este tiempo, los embriones son en su mayoría la etapa 15, lo que permite suficiente tiempo para resolver los embriones para la expresión de las buenas prácticas agrarias y la línea a ellos, para que puedan estar en la etapa 16 cuando la disección se realiza.

7. Puesta en escena de embriones y la clasificación para la expresión de GFP.

Al discriminar los genotipos de los embriones, se utiliza balanceadores de las buenas prácticas agrarias. Se examinan los embriones dechorionated en doble vara de cinta (ver próxima sección) en una disección de las buenas prácticas agrarias Olympus alcance, y los seleccionamos para la edad y la expresión de las buenas prácticas agrarias, al mismo tiempo.

a) las buenas prácticas agrarias de clasificación:

1. El equilibrador segundo cromosoma que utilizamos (CyOarmGFP) ha GFP dirigido por el promotor armadillo, que se expresa a través del ectodermo. Heterocigotos CyOarmGFP son de color verde oliva, y los homocigotos CyOarmGFP son de color verde brillante. En una acción CyoarmGFP, los embriones que no tienen el balanceador se distinguen fácilmente, ya que casi no tienen la expresión de GFP (se parecen a los embriones de una acción sin balanceador GFP).
2. El equilibrador cromosoma 3 (TM3armGFP) es más difícil de utilizar para la ordenación, ya que tiene una expresión más la madre impulsado GFP. Como resultado, los embriones se dividen en categorías más y menos verde. Con algo de práctica, por lo general es fácil de clasificar los embriones menos verde y más el uno del otro, pero también es necesario recurrir a ellos por la agrupación de ellos y elegir los embriones ocasionales que son más verdes que las otras (heterocigotos TM3armGFP) después de la transferencia a la placa de agar. De lo contrario, no están seguros de ser unos embriones que son del genotipo incorrecta.
3. El equilibrio de X es FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Esto se expresa en un patrón de tejido-específica. Los patrones que son relevantes para la clasificación en etapas es el amnioserosa 15-16 y dos puntos de expresión en la cabeza, que son las células Bolwig de órganos. Por desgracia, en la etapa en que se quiere ordenar embriones, la amnioserosa se está desvaneciendo y los órganos Bolwig aún no han comenzado a brillar. Por tanto, es necesario examinar cuidadosamente los embriones en la cinta, a menudo dando vueltas, a cuenta de las buenas prácticas agrarias, y es esencial para recurrir en la placa de agar. Por lo general lo hacemos dos veces: una vez inmediatamente después de mover todos los embriones de la cinta a la placa, y de nuevo después de un envejecimiento de la suficiente antelación, antes de alinearlos en la preparación para la disección. A veces, también volver a examinar la diapositiva en el ámbito GFP después de la transferencia de los embriones a la piscina PBS (ver más abajo), ya que la visualización de las buenas prácticas agrarias es mejor en estas condiciones. Entonces, podemos destruir los embriones que tienen las buenas prácticas agrarias justo antes de empezar la disección.

b) La estadificación

La herramienta principal para la puesta en escena alrededor de embriones st. 14-16 es la morfología intestinal. El intestino brilla con autofluorescencia en el ámbito GFP. Antes de tratar de embriones etapa, se debe consultar libros de referencia o en los sitios que tienen imágenes y diagramas de los embriones (por ejemplo, el Hartenstein y Campos-Ortega libro verde), por lo que uno entiende lo que debe ser similar. El escenario ideal para la disección es cuando el intestino se ha dividido en tres bandas. Antes de eso, el intestino aparece como una masa única. A menudo las clases de embriones en la etapa de burbuja y las edades ellos hasta que alcancen el mejor escenario para la disección. Después de la etapa de tres bandas, el intestino se empieza a desarrollar bandas diagonales cerca de la cola, y luego las bobinas, y el embrión se vuelve más clara. Dentro de este período, el embrión se convierte en difícil de analizar debido a que no se pegue en el portaobjetos de vidrio. Si uno quiere analizar última etapa 16/early etapa 17 embriones, es necesario analizar y evaluar la cantidad de embriones que morfologías intestino son los embriones que se adhieren o no se pegan. Esto varía un poco entre los genotipos también.

B. Drosophila disección embrión vivo

1. Embrión dechorionation
   1. Preparar cinta de doble cara adhesiva y la losa plato de uvas en una diapositiva
   2. La transferencia de los embriones con edades comprendidas entre la placa de la colección de la cinta adhesiva de doble cara con un pincel mojado. Propagación de embriones de manera uniforme.
   3. Dechorionate los embriones en la cinta adhesiva de doble cara por ellos a través de rodar suavemente con una aguja roma disección. Después de dechorionation, los embriones se adhieren más fuertemente a la final de la aguja, que a otros embriones o el corion, pero no tan intensamente como en la cinta, por lo que se rueda en la parte superior de los embriones del corion, o en otros embriones, luego levanta que fuera y lo transfiere a la losa de la placa de la uva. Genotipificación y puesta en escena (ver más arriba para una descripción detallada) se hace durante el proceso de dechorionation ytransferencia a la aguja.
   4. Después de recurrir para el genotipo y la edad, los embriones se mueven a una losa rectangular más pequeña de agar, de anchura suficiente para permitir la alineación de 10 a 15 embriones en una fila. Alinear los embriones dechorionated en esta losa: cara dorsal hacia abajo contra los extremos agar losa y posterior mirando hacia usted. Por lo general hacen filas de embriones 50-10.
2. Prepare una diapositiva y la transferencia de embriones para la disección en vivo
   1. Corte un pequeño trozo rectangular de doble cara cinta adhesiva y coloque cerca de un extremo de Super Frost / Además de diapositivas (Fisher Scientific, Cat # 12-550-15).
   2. Dibuje un rectángulo (30-40 mm de largo y el ancho de la diapositiva) en torno a la cinta con un lápiz de cera, de modo que no es de ~ 3 mm de espacio entre la cera y cinta (Super Pen Pap HT, www.rpicorp. com ) y la transferencia de los embriones de la losa de la placa de la uva en la cinta, por inversión de la diapositiva y suavemente bajar en los embriones, de modo que la cinta entra en contacto con los embriones alineados (se hace bajo un microscopio de disección). Los embriones deben estar alineados para que el extremo posterior es hacia usted. Ahora será hasta la parte dorsal de la diapositiva.
   3. Inmediatamente agrega 1X PBS (Gibco receta) a través de los embriones para rellenar el rectángulo de cera.
3. Embrión vivo disección
   1. Utilizando una aguja de disección de vidrio (a partir de una aguja de inyección), corte a lo largo de la línea media dorsal, desde el extremo posterior del embrión.
   2. Poke la parte anterior del embrión, levante y la transferencia del embrión a la diapositiva hasta que se pegue. Mantener los embriones en el buffer. Hacer una fila ordenada de los embriones en la diapositiva que corresponda a cada fila de la placa de agar. Organizar las filas para que todos ellos caben en la diapositiva.
   3. Hay una variedad de secuencias de disección posibles que se pueden utilizar en la generación de filetes. Las personas suelen desarrollar sus propios procedimientos optimizados a través de hacer las mismas disecciones. El vídeo muestra una secuencia en la que se hace un pequeño corte en el extremo posterior del embrión para separar los dos lados de la pared del cuerpo de la otra. Si lo desea, también se puede romper la conexión del intestino medio / intestino grueso con este corte, y desplazar el intestino grueso a cabo en la diapositiva en este momento (en el video, el desplazamiento del intestino grueso se hace más adelante). A continuación, se realizan cortes a cada lado justo por detrás de los lóbulos del cerebro para separar las paredes del cuerpo desde el cerebro. Dependiendo de la edad del embrión, también se puede necesitar para hacer un corte poco profundo por la línea media dorsal de cortar la conexión amnioserosal entre las paredes del cuerpo.
   4. Entonces, suavemente pasta por las solapas de la pared del cuerpo en la diapositiva, evitando que se extiende o arrancando material de su superficie. Esto se hace mejor, permitiéndose sólo la aguja en contacto con las esquinas anterior y posterior en los bordes dorsal de la pared del cuerpo. Los axones de motor no se extienden tan lejos dorsal, por lo que en el mejor de los casos esto se produce un embrión con ramas ISN completamente intacta. En algunos casos, el ISN se truncará, incluso con la mejor técnica, porque el embrión no siempre se separa exactamente a lo largo de la línea media dorsal. Si se hace correctamente, este método se conservan las estructuras de la pared del cuerpo en segmentos T3-A6 (aproximadamente).
   5. Uno puede dejar el intestino en la parte superior del embrión, y luego lo elimina de todos los embriones disecados después de terminar todas las disecciones. Esto se hace metiendo la tripa, desplazando a la basura a partir del embrión, y se extiende a romper su conexión con el intestino anterior, que se encuentra en los lóbulos del cerebro. O bien, se puede quitar el intestino de cada una disección que se complete. Con los mutantes que tienen un desarrollo anormal del intestino, que es una ventaja para eliminar todas las tripas a la vez después de terminar la disección, porque la yema liberada en el intestino puede hacer que sea más difícil seguir adelante embriones a transferir a la diapositiva después de la transferencia de la cinta doublestick . A veces es útil para transferir los embriones a partir de la parte inferior de la diapositiva (a usted) en lugar de en la parte superior, como la yema tiende a extenderse hacia usted, debido a los movimientos típicos de la aguja.
4. La fijación y la inmunofluorescencia / inmunohistoquímica
   1. En este punto, uno puede fijar los embriones de inmediato, si es la tinción con anticuerpos, o se puede retirar el PBS y reemplazarlo con sobrenadante de proteína de fusión, si uno está haciendo un experimento en vivo tinción para detectar la expresión del ligando. Este aspecto del experimento es descrito en detalle en los métodos y las secciones de métodos complementarios de ref. [5].
   2. A continuación se describe el protocolo de fijación, que se realiza de forma inmediata o después de la tinción de proteínas de fusión. El uso de dos pipetas Pasteur, reemplace el PBS con 5% de paraformaldehído en PBS (EMS, cat. # 15713-S, www.emsdiasum.com). Cambio en la solución de fijar en tres ocasiones, lo que implica el uso de ~ 6 ml de solución de arreglo, ya que tiene una pipeta Pasteur1,5-2 ml de solución. Arreglo para el 45 '.
   3. Quitar fijar solución, reemplace con PBS (3 cambios), luego con PBT (PBS + 0,1% Triton X-100 + 1 mg / ml de la fracción V de BSA, 3 cambios), y luego reemplace PBT con ~ 200 l bloque de solución (PBT + 5 tratamiento térmico% de suero normal de cabra), con el anticuerpo primario deseado en la solución de bloqueo. Es muy importante no permitir que el menisco en contacto con los embriones, sobre todo mientras están en PBS, ya que esto va a destruir las disecciones. Después de detergente se añade que los embriones se vuelven menos sensibles a los meniscos. Así, se puede reemplazar el PBT con el bloque por el depósito de la diapositiva y borrando la mayor parte de la solución al tocar un Kimwipe brevemente a la esquina de la zona delimitada por la cera. El mismo método puede ser usado para reemplazar el bloque con una solución contra el cuerpo. Esto minimiza el arrastre de las soluciones.
   4. Incubar toda la noche a 4 ° C, lavar 3 veces con PBT (> 15 minutos / lavado) en una bandeja sobre una plataforma oscilante (asegúrese de que hay suficiente PBT para que la diapositiva es siempre completamente inmerso en mecedora), reblock como se describió anteriormente, añadir 200 l de anticuerpo secundario, se incuba 2 horas. a temperatura ambiente, vuelva a lavar con PBT. Compruebe manchas (si se utiliza la fluorescencia verde) si se desea en el ámbito de la disección de las buenas prácticas agrarias.
   5. Lavar 2 veces con PBS (5 '), a continuación, añadir 500 l 70% glycerol/1X PBS (hace mezclando 35 ml de glicerina, 5 ml de PBS 10X, y 10 ml de agua en un tubo de 50 ml), y durante la noche clara a 4 ° C (o durante 2 horas a temperatura ambiente). Eliminar el glicerol y se puso un cubreobjetos # 1.

Discussion

Esperamos que este video de demostración ha mostrado nuestros métodos de disección de embriones vivos y la tinción con el suficiente detalle que ahora pueden ser fácilmente ejecutadas por cualquier persona que tenga alguna experiencia en Drosophila genética y la embriología. Por supuesto, mucha práctica seguirá siendo necesaria, sobre todo para las propias disecciones. En nuestra experiencia, cada persona que aprende los métodos de disección en vivo va a crear un protocolo de disección sutilmente diferente que le permite a él / ella para generar más rápidamente de alta calidad disecciones vestidos. Este proceso requiere meses para su pleno desarrollo. Sin embargo, la mayoría de las personas de generar alta calidad disecciones después de algunas semanas de práctica.

A pesar de que favorecen el uso de las disecciones en vivo para la investigación, no pueden sustituir a las disecciones fijo, porque los protocolos fija la disección se puede aplicar a una gama más amplia de las fases embrionarias. Por ejemplo, en el análisis de nuestro equipo del DF, fenotipos motor para guía de axones, se encontró que los detalles de las ramas del axón motor, incluidos los filopodios, puede ser mucho mejor visualizado por tinción de inmunofluorescencia de los filetes de vivir que por convencionales peroxidasa de rábano (HRP) de visualización de inmunohistoquímica de filetes de fijo (por ejemplo de alta calidad tinción HRP, consulte el manual del motor para guía de axones en nuestra página web de laboratorio). Sin embargo, los embriones más viejos que el comienzo de la etapa 17 no se pegue a SuperFrost Plus diapositivas, debido a su desarrollo de cutícula. Por lo tanto, para el análisis cuantitativo de los fenotipos de desarrollo tardío ramas motoras del axón, como en el SCN, que todavía dependen de las disecciones fijo (AW et al., En preparación).

En la actualidad, estos métodos sólo se han aplicado a algunos problemas de nuestro grupo. Estos incluyen la identificación y el análisis fenotípico de nuevos genes implicados en el sistema nervioso central y motor de guiado de los axones, la identificación de ligandos del receptor huérfano, y la identificación de los genes necesarios para la síntesis de los epítopos reconocidos por los mAbs específicos. Sin embargo, muchas otras aplicaciones se pueden prever, especialmente cuando estos métodos se combinan con el análisis de nuestro kit de recolección de Df y la expresión ectópica, o de las colecciones generadas por otros investigadores. Por ejemplo, debería ser posible a la pantalla de forma sistemática por los genes necesarios para la síntesis, el patrón de expresión celular, o la localización subcelular de cualquier proteína que puede ser detectado por un anticuerpo de alta calidad o un reportero GFP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate Tubing With Filament	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Narishige model PC-10 needle puller	Narishige International		Tubes pulled using a heater level of 58.9