Summary
우리는 특정 genotypes의 Drosophila의 배아의 "등심"준비 창출을위한 능률적인 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 화면의 다양한 효율적인 실행을 허용합니다. 또한 후반 배아의 구조 우수 시각화 수 있습니다.
Abstract
배아 발달의 단계 14 17 사이의 Drosophila의 배아는 쉽게 "등심"준비를 생성하기 위해 해부를하실 수 있습니다. 이러한 준비에서, 중추 신경 시스템은 중앙을 실행하고, 신체 벽 둘러싸인 있습니다. 여러 phenotypes는 그러한 준비를 사용하여 검사하고 있습니다. 대부분의 경우 필레는 항체 묻은 고정 전체 마운트 배아의 절개로 생성되었습니다. 이러한 "고정 해부는"그러나 일부 단점이 있습니다. 그들은 실행 시간이 소비되며,이 변이는 GFP 밸런서 염색체 이상 유지하는 주식에서 돌연변이 (GFP - 음수) 배아를 정렬하기가 어렵습니다. 2002 년부터, 우리 그룹은 고아 수용체에 대한 리간드를 식별 결핍 및 이소성 표현 화면을 실시하고 있습니다. 이 작업을 수행하기 위해서는, 우리가 사는 배아 해부하고 균형잡힌 라인의 수백을 포함하는 컬렉션의 항체 염색법에 대한 능률 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 고정 절개로보다 라이브 절개로 주식의 대규모 컬렉션에 phenotypes을 검토하기 위해 상당히 더 효율적이라고 결론을 내렸다있다. 프로토콜 여기에서 설명한을 사용하여, 하나의 훈련 개인은 복합 현미경으로 각 라인 4-7 돌연변이 배아를 조사 phenotypes에 대해 하루에 10 라인까지 스크린 수 있습니다. 이렇게하면 한 줄에 최대 70 hemisegments가 40X 물 침지 렌즈 높은 배율의 점수이기 때문에 미묘한, 낮은 penetrance phenotypes를 부여 변이의 식별.
Protocol
소개
배아 발달의 단계 14 17 사이의 Drosophila의 배아는 쉽게 "등심"준비를 생성하기 위해 해부를하실 수 있습니다. 이러한 준비에는 중추 신경계 (CNS)는 중앙을 실행하고, 신체 벽 둘러싸인 있습니다. 창자가 제거됩니다. 준비와 사이에 개입에는 조직이 없기 때문에 항체 물들일 때, 필레는 전체 마운트 배아보다 CNS 및 신체 벽 구조 (예 : 모터 axons, 근육, 말초 감각 (PNS) 뉴런, tracheae)의 훨씬 더 시각화를 허용 coverslip, 그리고 생선 토막 시체 벽에 걸쳐 확장 구조는 하나의 초점 평면에 시각 수 있도록, 평면이기 때문에. 여러 phenotypes는 그러한 준비를 사용하여 검사하고 있습니다. 대부분의 경우, 필레은 고정, 항체 - 스테인드 전체 마운트 배아의 절개로 생성됩니다. 이러한 고정 준비는 다음 단계에 의해 생성됩니다 : 글리세롤의 클리어링 5),, 메탄올 3) vitelline 막 제거,, immunohistochemistry 또는 immunofluorescence를 사용하여 4) 항체 염색법, paraformaldehyde / 헵탄 2) 고정 1) 표백제와 chorion 제거 6) 텅스텐 바늘로 해부. 이러한 "고정 해부"을 얼룩에 대한 자세한 프로토콜은 심판에 제공됩니다. [1].
고정 해부 그러나, 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 안티 GFP가 검색에 사용되는 고정도, 스테인드 돌연변이 (GFP - 음수) 주식 또는 돌연변이 GFP balancers을 통해 균형있는 십자가에서 배아를 정렬하는 것이 어렵습니다. 이것은 GFP의 모성 표현을 포함하여 다양한 요인에 의한 것입니다. 예를 들어, 우리는 굴지 - GFP 또는 아르마 딜로 (팔) 중 - GFP balancers를 사용하여 균형 셋째 염색체 주식에서 고정, 스테인드 homozygous 돌연변이 배아를 정렬하려면 거의 불가능 것으로 나타났습니다. 둘째, 그것은 높은 품질의 고정 해부를 생성하는 것은 매우 시간이 소모됩니다. 대부분의 사람들이 할 수처럼 시속 10-15 정도로 빠릅니다. 항체가 얼룩이 모두 내부 및 외부 구조 외부 구조에 의해 "흡수"이고 내부 구조에 침투하지 않기 때문에 항체 epitopes가 수정에 민감한, 또는 때문에 셋째, 어떤 항체가 (역시 고정 해부에 잘 착색하지 fasciclin III (Fas3))에 대한 항체 예. 리간드 표현을 감지하는 수용체 융합 단백질과 넷째, 라이브 얼룩은 고정 준비를 할 수 없습니다.
2002 년부터, 우리 그룹은 RPTP 리간드를 식별하는 결핍증 (DF) 및 이소성 표현 화면을 실시하고 있습니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 균형 잡힌 라인의 수백을 포함하는 컬렉션의 라이브 배아 해부와 얼룩에 대한 간소화된 프로토콜을 개발했습니다. 수용체 융합 단백질과 함께 고아 수용체 리간드에 대한 얼룩하면 여러 그룹에 의해 고용되지 않는 전문적인 응용 프로그램입니다. 그러나 많은 그룹은 배아 phenotypes을 시각화하기 위해 필레의 항체 염색법을 사용합니다. 이러한 방법의 개발을 통해, 우리는 그것이 고정 절개로보다 라이브 절개로 주식의 대규모 컬렉션에 phenotypes을 검토하기 위해 상당히 더 효율적이라고 결론을 내렸다있다. 우리는 600 개 이상의 DFS에 모터 축삭, CNS, 그리고 근육 phenotypes를 특징 사는 절개를 사용한, 또한 400 개 이상 다른 세포 표면의 이소성 표현과 분비 단백질 (AW 외 준비에 의해 만들어진 신경 시스템 phenotypes를 묘사했습니다.; HK. L. 외., 준비).
우리가 사용한 라이브 해부 프로토콜은 년 동안 진화했습니다. 저자 중 하나 (KZ)은 처음엔 코리 굿맨의 실험실에있는 대학원 학생 시절 Nipam 파텔에 의해 20 년 이상 전에 절개를 살 도입되었습니다. 더 최근에는, 우리는 다른 모든 실험에 대한 안티 Fas3 [2]하지만, 고용 고정 해부와 CNS를 얼룩이 메서드를 사용합니다. 1999 년, 다음 Aloisia 슈미트, 우리 그룹의 postdoc, 우리는 그녀가 두 번 좌초 RNA - 주입된 배아 [3, 4]에서 phenotypes을 검사하는 데 사용되는 유리 바늘과 절개를 사는 발표했다. 우리가 몇 년 후 RPTP의 리간드 화면을 시작하는 때, 우리는 GFP balancers 이상 유지 주식의 대규모 컬렉션의 빠른 분석을 허용하는 그녀의 프로토콜을 수정했습니다. 우리는 배아가 GFP 발현에 살고 미묘한 차이를 쉽게 감지할 수 정렬되어 있기 때문에 실질적인 모성 GFP 표현식이 (TM3armGFP 균형 조정 예 :),이 경우에도 GFP - 부정 배아 쉽게 GFP 균형 주식에서 정렬할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 라르 리간드에 대한 우리의 성공 DF 화면 [5]에 설명되어 있습니다.
현재 프로토콜을 사용하여 하나의 훈련 개인은 복합 현미경으로 각 라인 4-7 돌연변이 배아를 조사 phenotypes에 대해 하루에 5-10 라인을, 스크린 수 있습니다. 배아를 선택하고 arraying 후 50 배아를 해부하다하는 약 1 시간 걸립니다. 이 방법은 우리가 미묘한, 낮은 penetra를 부여 변이를 확인하실 수 있습니다제정신의 phenotypes는 한 줄에 최대 70 hemisegments 이후 40X 물 침지 렌즈 높은 배율의 점수입니다. 이러한 phenotypes는 해부 현미경 스테인드 전체 마운트 배아의 화면에서 감지 어렵거나 불가능하다.
우리는 약 250 라인을 포함하고 게놈의 약 절반 (AW 외., 준비)를 나타냅니다 phenotypic 검사 DF 키트를 정의했습니다. 그것이 RPTP의 리간드 합성 [5]에 필요한 유전자를 위해 2002-2003에 존재 본 키트의 개발은 블루밍턴 DF 키트 우리의 스크린의 일환으로 시작되었다. 이 화면의 과정에서, 우리는 DF / DF homozygotes 더 발전했다 낫게 molecularly 매핑 작은 DFS와 CNS를 (그리고 따라서 CNS의 리간드 발현에 대한 검사 수 없습니다), 개발 안되는 블루밍턴 키트 DFS를 교체했다.
우리 phenotypic 검사 키트의 라인에서 DF / DF homozygotes은 CNS, PNS, 근육 섬유, tracheal 네트워크 및 다른 많은 조직의 개발에 영향을 미치는 유전자에 대한 체계적 화면에 수사관을 허용, 단계 16 일반 전체 morphologies 있습니다. 모든 구조, 표현 패턴, 또는 단계 14-16에서 특정 항체 또는 GFP 표시와 함께 visualizable 있습니다 subcellular 지방화 패턴이 키트를 사용 phenotypes에 대한 검사를하실 수 있습니다. 이것은 프로토콜을 사용하면 여기에 설명된 내용, 의미, 그 중 절반 /이 프로젝트에 그녀의 시간에 대한 한 사람의 지출은 체계적으로 1 년 6 개월 이내에 원하는 배아 표현형 모든 Drosophila의 유전자의 절반을 스크린 수 있습니다.
A. Drosophila의 배아 컬렉션
1. "다섯 배럴"달걀 수집 회의소 준비
플라이 라인의 큰 숫자를 조사하면 이러한 챔버 스는 시간과 노력을 저장합니다.
- 거꾸로 실리콘 고무 접착제 밀봉제를 사용하여 함께 100 X 15mm 플라스틱 페트리 접시와 접착제 튜브의 아래쪽에 다섯 50mL 코니컬 튜브를 배열.
- 일단 접착제는 접착제는 페트리 접시의 바닥 부분은 튜브의 끝을 원뿔에, 경화됩니다. 다섯 원뿔 튜브는 페트리 접시의 안쪽에 서서 것입니다.
- 뜨거운 바늘을 사용하여 공기 순환을위한 튜브에 구멍을합니다.
2. 달걀 수집 번호판을 준비
- 각 100 X 15mm 플라스틱 페트리 접시에 포도 한천 겔 (1 %)의 7mL에 대한 하거라. 젤의 이상적인 두께는 각 원뿔 튜브를 밀봉하고 24 시간 동안 수분을 제공하기 위해 3-4밀리미터에 대한 것입니다. 젤이 너무 두꺼운 경우, 우리가 번호판을 변경하면 아래로 떨어질 수 있습니다.
- 겔 접시 식혀 후, 커버와 원래 플라스틱 페트리 접시 가방에 이것을 넣어. 4 단단히 가방을 밀봉하여 저장 ° C.
3. 파리 준비
- 올바른 단계의 배아 쉽게 선택할 정도로 달걀을 얻기 위해, 우리는> 20 남성과 함께 십자가에> 50 처녀 넣어보십시오.
- 교차 상영하는 경우의 중간에 심은 바닥에 건조 효모 알약 많은과 (반 접힌 10 X 100mm) 얇은 종이 스트립과 플라이 식품 약병에있는 남성과 여성의 파리를 섞어 유지 음식. 종이 스트립 더 많은 면적을 제공하고 과도한 수분의 파리를 유지합니다.
- 적어도 3 일 동안 RT에서 파리로 병을 보관하십시오.
- 병에서 재고가 상영하는 경우, 단순히 수집 챔버로 파리를 전송합니다.
4. 전송이 5 통 계란 수집 방으로 날아.
- 달걀 수집 챔버의 각 폐기물을 분류.
- 각 배럴을위한 계란 수집 접시에 효모 붙여 놔.
- 함께 챔버와 접시를 개최 20 인치 긴 라벨 테이프를 준비합니다. 쉬운 플레이트 변경 각 끝에 10mm를 접으십시오.
- 파리 유리병에 CO 2 가스를 삽입하고 표시된 배럴로 파리를 전송합니다.
- 계란 컬렉션 플레이트와 챔버 커버 아래로 누르십시오.
- 챔버 및 한천 플레이트의 중간부터 함께 접시 주위에 테이프. 테이프 계란 수집 접시에 중첩됩니다.
5. 배아를 수집
- 달걀 수집 판을 준비 : 각 배럴을위한 계란 수집 접시에 효모 붙여 놔.
- 달걀 수집 실에서 파리를 누르고 (단단히 이전 판 잡고) 실 주위에 테이프를 제거합니다.
- 다시 파리를 누르과 새로운 하나 기존의 플레이트를 교체하십시오.
- 2~4시간 위해 한쪽으로 치우 쳤던 자리에 배아를 수집합니다.
- 원하는 시간에 계란 수집 판을 교체하십시오.
6. 연령 배아
서부 유럽 표준시 90mm 서클 필터 종이 덮여 페트리 접시에 거꾸로 계란 컬렉션 플레이트를 삽입하고 원하는 온도에 유지. 단계 균형 돌연변이 라인에서 16 태아의 해부 들어, 우리가 일반적으로 늦은 아침에 컬렉션을 다음에 대한 배아를 품어19 R> 22 HR ° UAS/GAL4 시스템을 사용하여 이득의 기능 연구에 대한 C., 우리는 19 16 시간을위한 오후 및 부화에 RT에서 배아를 수집 ° C.를 다음날 우리는 1 개 또는 2 시간에 대한 UAS/GAL4 시스템을 활성화하기 위해 29 ° C 배양기에 배아를 전송합니다. 시간이 금액 후, 절개가 완료되면 그들은 단계 16에있을 수 있도록, 배아는 대부분 무대 15아르, 이것은 GFP 발현을위한 배아를 정렬하고이를 줄을 충분한 시간을 허용합니다.
7. 배아를 준비하고 GFP 발현을위한 정렬.
배아의 genotypes을 차별하기 위해, 우리는 GFP balancers을 사용합니다. 우리는 범위를 해부 올림푸스 GFP 아래에서 더블 스틱 테이프에 dechorionated 배아 (다음 섹션 참조) 조사하고, 우리는 같은 시간에 나이와 GFP 발현 그들을 선택합니다.
A) GFP가 정렬 :
- 우리가 사용하는 두번째 염색체 균형 (CyOarmGFP)는 ectoderm에 걸쳐 표현되는 아르마 딜로의 발기인에 의해 주도 GFP 있습니다. CyOarmGFP의 heterozygotes 올리브 녹색이며, CyOarmGFP의 homozygotes 밝은 녹색입니다. 그들은 거의 GFP 발현을 (그들은 없음 GFP의 균형있는 주식에서 태아 모습)이 없기 때문에 CyoarmGFP 재고에서 균형이 결여되어 태아가 쉽게 구분할 수 있습니다.
- 더 maternally 중심의 GFP 발현을 가지고 있기 때문에 제 3 염색체 균형 (TM3armGFP)은 정렬에 사용할 어렵습니다. 그 결과 태아는 더 적은 녹색 범주로 나누어집니다. 연습으로, 그것은 서로 덜 더 녹색 배아를 정렬하기 위해 일반적으로 간단하지만, 그것은 그들을 클러스터링 및 전송 후 (TM3armGFP의 heterozygotes) 다른 사람보다 더 녹색 가끔 배아를 채취하여이를 리조트에도 필요합니다 한천 플레이트합니다. 그렇지 않으면 잘못된 유전자형의 일부 배아가 반드시있다.
- X 밸런서는 FM7 KR - GAL4, UAS - GFP입니다. 이것은 조직을 특정 패턴으로 표시됩니다. 15-16 단계에서 분류와 관련된 패턴은 amnioserosa과 Bolwig의 장기 세포의 머리에 표현의 두 지점입니다. 불행히도, 하나 배아를 정렬하고자하는 단계에서, amnioserosa가 흐려지고 있으며 Bolwig의 장기는 아직 발광하기 시작하지 않았습니다. 그것은 종종 GFP 그들을 점수, 그들을 통해 압연, 테이프에 배아에서 잘 볼 따라서 필요하며, 그것은 한천 플레이트 그들을 리조트하는 것이 필수적입니다. 보통 우리는 두 번 다음을 수행 한 바로 접시에 테이프의 모든 배아를 이동한 후, 다시 적절한 무대 노화 후 바로 해부를위한 준비에 안감을하기 전에. GFP의 시각화 이러한 조건에서 더 나은이기 때문에 때때로, 우리는 또한, PBS 수영장 (아래 참조)에 배아의 전송 후 GFP 범위에서 슬라이드를 다시 확인합니다. 그런 다음, 우리는 그냥 절개를 시작하기 전에 GFP를 배아를 파괴할 수있다.
B) 스테이징
세인트 주위 배아를 준비를위한 기본 도구입니다. 14-16은 굿 형태입니다. GFP 범위에 따라 autofluorescence있는 굿 반짝 거 려요. 이전 단계의 배아를 시도하기 위해, 하나는 하나는 그들의 모습을해야하는지 이해하도록, 참고 서적이나 (Hartenstein 및 캄포스 - 오르테가 녹색 책을 예) 그림과 배아의 다이어그램을 가지고 사이트를 참조해야합니다. 해부를위한 이상적인 단계는 직감 세 밴드로 나누어했을 때입니다. 그 전에, 직감은 단일 BLOB으로 나타납니다. 사람들은 종종 정렬 BLOB 단계에서 배아 그리고 그들이 해부를위한 최고의 무대를 도달할 때까지 그들을 세. 세 밴드 무대 후, 용기를 대각선 꼬리 근처 밴드, 그리고 코일을 개발하기 시작하고, 난자는 명확됩니다. 그것은 유리 슬라이드에 남아 있지 않으므로이 기간 내에 배아는 해부하다 어려운됩니다. 하나 16/early 단계 17 배아를 늦게 무대를 해부하다하고자하는 경우, 그것은 많은 배아를 해부하다하고 굿 morphologies가 스틱이나 스틱하지 배아과 관련된 어떤 평가가 필요합니다. 이것은뿐만 아니라 genotypes 사이에 약간 다릅니다.
B. Drosophila의 배아 라이브 해부
- 배아 dechorionation
- 슬라이드에 양면 스티커 테이프와 포도 플레이트 슬래브 준비
- 젖은 페인트 브러쉬를 사용하여 양면 스티커 테이프 모음 판에서 노인 배아를 전송합니다. 고르게 배아를 확산.
- 무딘 해부 바늘로 부드럽게 통해 그들을 압연하여 양면 스티커 테이프에 배아를 Dechorionate. dechorionation 후 배아가 다른 태아 또는 chorion보다 바늘의 끝에 더 강하게 붙어 있지만 같은 강력 테이프로 것이며 따라서 chorion 위에이나 다른 배아에 한 롤 배아, 그때 리프트 속보 이는 짓 그만하고 포도 플레이트 슬래브에 전달합니다. Genotyping 및 (자세한 설명은 위 참조) 준비하기 dechorionation의 과정에서 수행하고있다바늘로 전송할 수 있습니다.
- 유전자형과 나이에 resorting 후 연속으로 10-15 배아 최대 안감 수 있도록 충분한 넓이의 한천의 작은 사각형 슬래브로 배아를 이동합니다. 당신쪽으로 향하게 한천 슬래브 및 사후 종료에 대한 다운 등의 측면이 슬래브에 dechorionated 배아를 맞춥니다. 우리는 일반적으로 50-10 배아의 행을 확인합니다.
- 라이브 해부에 대한 슬라이드 및 전송 배아 준비
- 양면 스티커 테이프의 작은 사각형 조각을 잘라 슈퍼 프로스트 / 플러스 슬라이드 (피셔 과학, 고양이 # 12-550-15)의 한쪽 끝을 근처에 놓으십시오.
- 왁스 펜으로 테이프 주위에 직사각형 (길이 30-40밀리미터 및 슬라이드의 전체 너비)을 그려, 왁스 테이프 (슈퍼 HT의 자궁암 펜 사이의 공간 ~ 3mm가되도록 www.rpicorp가. COM ) 및 반전 슬라이드에 의해 테이프에 포도 플레이트 슬래브의 배아를 전송하고 부드럽게 테이프가 줄지어 업 배아 (해부 현미경 완료) 접촉으로 제공하므로, 배아에 그것을 낮추는. 배아는 사후 끝이 당신을 향한되도록 정렬한다. 그들은 이제 슬라이드 등의 측면까지 것입니다.
- 즉시 1X PBS는 (Gibco 요리법) 왁스 사각형을 채울 수있는 배아를 통해 추가할 수 있습니다.
- 배아 라이브 해부
- 유리 해부 바늘 (주사 바늘로 만든)를 사용하여 배아의 뒷부분 끝에서 시작 등의 정중선을 따라 했네요.
- 배아의 앞쪽에 끝을 포크, 들어올려하고 스틱 때까지 슬라이드 배아를 전송합니다. 버퍼의 배아 보관하십시오. 한천 슬래브의 각 행을 일치하는 슬라이드에 배아의 줄을 확인합니다. 그들이 모든 슬라이드에 맞게 수 있도록 행을 구성합니다.
- 필레을 생성에서 사용할 수있는 가능성 해부 시퀀스 다양한있다. 사람들은 일반적으로 해부 스스로 일을 통해 자신의 최적의 절차를 개발할 수 있습니다. 비디오는 작은 상처가 서로의 몸을 벽의 양쪽을 분리하는 배아의 사후 끝에 만들어진되는 순서를 보여줍니다. 원하는 경우, 어떤 사람은 상처와 midgut / hindgut 연결을 깰 수 있으며, (비디오, hindgut 변위가 나중에 이루어집니다) 이번에 슬라이드에 hindgut를 치환. 그런 다음, 상처는 두뇌에서 신체 벽면을 구분하기 위해 뇌 엽 (叶) 단 후부 양쪽에 만들어집니다. 배아의 연령에 따라 어떤 사람은 신체 벽 사이의 amnioserosal 연결을 끊을 수있는 등의 정중선 아래 얕은 상처를 만들 필요가 있습니다.
- 그런 다음 부드럽게 스트레칭을하거나 표면에서 물질을 제거하는 피하 슬라이드에 본문 벽의 펄럭 아래로 붙여 넣습니다. 이 가장은 바늘이 몸을 벽 등의 모서리에있는 앞쪽에 및 사후 모서리 연락을함으로써 이루어집니다. 모터 axons이 최고의 사건이 전혀 손상되지 않는 지점이있는 배아를 생성되므로, 지금까지 dorsally이 확장하지 않습니다. 배가 항상 등의 정중선을 따라 정확히 구분하지 않기 때문에 어떤 경우에는되지 않는가, 심지어 최고의 기술과 잘리게됩니다. 제대로 경우,이 방법은 (약) T3 - A6 세그먼트에있는 신체 벽 구조를 유지합니다.
- 하나는 배아 위에 midgut두고, 그 후에 모든 해부가 끝난 후 모든 해부 배아에서 제거할 수 있습니다. 이것은, 용기를 파고 배아에서 멀리 생기죠하고 뇌 엽 (叶) 아래에 자리잡고 foregut에의 연결을 깨고 그것을 스트레칭을 통해 이루어집니다. 사람이 그것을 완료 또는, 하나는 각각의 해부에서 창자를 제거할 수 있습니다. 비정상 굿 개발을 돌연변이로, 그것은 창자에서 발표 노른자가 더 어려워 doublestick 테이프에서 전송 후 슬라이드 - 나중에 옮겨 배아를 메모리시킬 수 있기 때문에, 해부가 끝난 후 한 번에 모든 내장을 제거하는 장점이다 . 그것은 난황이 바늘의 전형적인 움직임으로 인해 당신을 향한 확산 경향으로 태아가 상단에 (당신을 향한) 슬라이드의 하단에있는 시작보다는 전송 가끔 도움이됩니다.
- 고정 및 immunofluorescence / immunohistochemistry
- 이 시점에서 하나가 항체와 얼룩 경우, 하나는 역시 즉시 배아를 해결하거나, 하나 리간드 발현을 검색하는 라이브 염색법 실험을하고있다면 하나는, PBS를 제거하고 융합 단백질 뜨는로 바꿀 수 있습니다. 실험의 이러한 양상은 심판의 방법과 보충 방법 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. [5].
- 여기도 즉시 또는 융합 단백질 얼룩 후에 이루어집니다 고정 프로토콜을 설명합니다. 이 파스퇴르 pipettes를 사용 PBS에서 5 % paraformaldehyde와 PBS를 교체 (EMS, 고양이. # 15713 - S, www.emsdiasum.com). 수정 솔루션에서 Exchange 파스퇴르 피펫이 보유하고 있기 때문에, 해결책의 ~ 6 ML을 사용하여 포함 세 번,솔루션의 1.5-2 ML. 45 '수정.
- 솔루션을 수정, 제거, PBT와 다음, PBS (3 변화)로 대체 (PBS + 0.1 % 트리톤 X - 100 + 1 MG / ML 분수 V BSA, 3 변경) 후 ~ 200 μl 차단 솔루션 (와 PBT 교체 PBT + 5 %의 열처리 정상 염소 혈청), 다음 블록 솔루션에서 원하는 기본 항체와 함께. 그들은 PBS에있는 동안이 해부를 파괴하므로 그것은 초승달 모양은 특히 태아에게 연락하는 것을 허용하지하는 것은 매우 중요합니다. 세제가 추가되면 태아는 초승달 모양에 덜 민감한된다. 따라서, 하나는 슬라이드 팁 및 왁스에 의해 둘러싸인 영역의 구석에 잠시 Kimwipe를 만져 대부분의 솔루션을 모래 바닥으로 블록과 PBT를 바꿀 수 있습니다. 같은 방법은 안티 바디 솔루션 블록을 대체하는 데 사용할 수 있습니다. 솔루션이 최소화 carryover.
- 4 밤새 품어 ° C, 그때 (PBT는 슬라이드가 항상 완전히 락을 동안 잠겨 있도록 충분히 있는지 확인하십시오) 로킹 플랫폼에서 트레이에 PBT (> 15분 / 씻고)로 3 배 세척, reblock은, 위에서 설명한 200 μl 이차 항체, 부화 2 시간을 추가하십시오. 알티, PBT와 rewash. 범위를 해부 GFP에 따라 원하는 경우 얼룩을 (녹색 형광을 사용하는 경우) 확인합니다.
- PBS (5 ')와 2X를 씻어 후 4 박 500 μl 70% glycerol/1X PBS (50 ML 튜브 35 ML의 글리세롤, 5 ML 10X PBS, 10 ML 물을 혼합하여 만든), 그리고 명확한를 추가 ° C (또는 RT에서 2 시간을 위해). 글리세롤을 제거하고 # 1 coverslip에 넣어.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는이 비디오 데모들은 지금 즉시 Drosophila 유전 발생학의 경험을 가진 사람에 의해 실행될 수있는 자료에 대해 충분하고 자세하게 사는 배아 해부와 얼룩을위한 방법을 표시했다 바랍니다. 물론, 상당한 연습은 여전히 주로 해부 자신을 위해 필요합니다. 우리의 경험에서 라이브 절개 방법을 배우는 모든 사람이 그 / 그녀가 가장 빠르게 고품질의 못하였 느니라 해부를 생성할 수 있도록 갑자기 ... 다른 해부 프로토콜을 생성합니다. 이 과정은 전체 개발에 대한 개월이 필요합니다. 그러나, 대부분의 사람들은 연습을 몇 주 후에 고품질의 해부를 생성할 수 있습니다.
우리가 검사를 위해 살고 해부의 사용을 선호하지만 고정 해부 프로토콜은 배아 단계의 넓은 범위에 적용할 수 있기 때문에, 그들은 고정 해부를 대체할 수 없습니다. 예를 들어, 모터 축삭지도 phenotypes위한 DF 키트의 분석, 우리는 filopodia를 포함한 모터 축삭 지점,의 세부 사항은 기존 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (HRP) immunohistochemical 시각화하여보다 라이브 필레의 immunofluorescent 얼룩에 의해 더 나은 시각 수있는 것으로 나타났다 고정 필레의 (고품질 HRP의 얼룩의 예를 들어, 실험실 웹 페이지에 모터 축삭지도의 뇌관 참조). 그러나, 단계 17 시작보다 오래된 태아는 SuperFrost에 충실 플러스 표피 그들의 발전에 따라 슬라이드를하지 않습니다. 따라서, 같은 SNA와 같은 늦은 개발 모터 축삭 지점에 대한 phenotypes의 정량 분석을 위해, 우리는 여전히 고정 해부 (AW 외., 준비)에 의존하고 있습니다.
현재 이러한 방법은 우리 그룹이 몇 가지 문제에 적용되었습니다. 이것은 신분증과 phenotypic 분석 CNS와 모터 축삭지도, 고아 수용체 리간드의 식별에 관련된 새로운 유전자와 특정 mAbs 인정 epitopes의 합성에 필요한 유전자의 식별을 포함합니다. 그러나, 다른 많은 응용 프로그램은 이러한 방법이 우리 DF 키트 및 이소성 표현 모음의 분석과 결합되어 특히, 구상, 또는 기타 조사에 의해 생성된 컬렉션이 될 수 있습니다. 예를 들어, 합성, 세포 표현 패턴, 또는 고품질의 항체 또는 GFP 기자에 의해 감지 될 수있는 단백질의 subcellular 지방화에 필요한 유전자에 대한 체계적 화면으로 수 있어야한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
우리는이 프로토콜을 개발하기 위해 공헌 니키 폭스 Aloisia 슈미트 감사드립니다. 이 작품은 KZ, NS28182하는 NIH RO1 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument Co. | BF120-60-10 | |
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige International | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
