Dissezione di vivere Drosophila Embrioni: Metodi semplificati per lo screening Collezioni Mutant dalla colorazione anticorpale

Summary

Noi descriviamo un protocollo semplificato per la generazione di "filetto" preparati di embrioni di Drosophila genotipi specifici. Questo protocollo permette l'esecuzione efficiente di una varietà di schermi genetica. Inoltre permette una visualizzazione eccellente delle strutture nell'embrione tardi.

Abstract

Embrioni di Drosophila tra 14 e 17 stadi dello sviluppo embrionale può essere facilmente sezionato per generare "filetto" preparati. In questi preparativi, il sistema nervoso centrale funziona a metà, ed è affiancato dalle pareti del corpo. Molti fenotipi differenti sono stati esaminati utilizzando tali preparati. Nella maggior parte dei casi, i filetti sono stati generati da dissezione di anticorpi colorati fisso intero montaggio embrioni. Questi "dissezioni fisso" sono alcuni svantaggi, però. Si tratta di tempo per eseguire, ed è difficile per ordinare mutante (GFP-negativo) gli embrioni provenienti da stock nel quale sono mantenute le mutazioni più cromosomi bilanciatori GFP. Dal 2002, il nostro gruppo sta conducendo carenza e schermi espressione ectopica di identificare ligandi per i recettori orfani. Per fare questo, abbiamo sviluppato protocolli ottimizzato per la dissezione dell'embrione dal vivo e colorazione degli anticorpi di raccolte contenenti centinaia di linee bilanciate. Abbiamo concluso che è molto più efficiente per esaminare fenotipi in grandi collezioni di scorte da dissezione dal vivo che da dissezione fisso. Utilizzando il protocollo qui descritto, un singolo individuo addestrato può schermo fino a 10 righe al giorno per fenotipi, esaminando 4-7 embrioni mutanti da ogni riga sotto un microscopio composto. Ciò permette l'identificazione di mutazioni conferimento sottile, a bassa penetranza fenotipi, dato che fino a 70 hemisegments per linea sono segnati a forte ingrandimento 40X con un acqua-immersion lente.

Protocol

Introduzione

Embrioni di Drosophila tra 14 e 17 stadi dello sviluppo embrionale può essere facilmente sezionato per generare "filetto" preparati. In questi preparativi, il sistema nervoso centrale (SNC) corre nel mezzo, ed è affiancato dalle pareti del corpo. L'intestino viene rimosso. Quando colorate con anticorpi, filetti di permettere la visualizzazione migliore del sistema nervoso centrale e strutture murarie del corpo (assoni motori ad esempio, i muscoli, sensoriale periferica (SNP) neuroni, trachee) di quanto non facciano con tutto il montaggio degli embrioni, perché non c'è tessuto intercorrenti tra la preparazione e la coprioggetto, e perché filetti sono piatti, permettendo strutture che si estendono attraverso la parete del corpo da visualizzare in un unico piano focale. Molti fenotipi differenti sono stati esaminati utilizzando tali preparati. Nella maggior parte dei casi, i filetti sono generate da dissezione di fisso, anticorpi macchiato di tutto il montaggio degli embrioni. Queste preparazioni fissi sono generati dalle seguenti fasi: 1) la rimozione corion con candeggina, 2) la fissazione con paraformaldeide / eptano; colorazione anticorpi 4) mediante immunoistochimica o immunofluorescenza;, 3) la rimozione della membrana vitellina con metanolo 5) di compensazione in glicerolo; 6) dissezione con aghi di tungsteno. Protocolli dettagliati per la colorazione di queste "dissezioni fisso" sono forniti in rif. [1].

Dissezioni fisso hanno alcuni svantaggi, però. In primo luogo, è spesso difficile per ordinare fisso, macchiato mutante (GFP-negativo) gli embrioni provenienti da stock o incroci in cui sono bilanciate le mutazioni più di bilanciatori GFP, anche se anti-GFP è utilizzata per il rilevamento. Ciò è dovuto a una varietà di fattori, compresa l'espressione materna di GFP. Per esempio, abbiamo scoperto che è quasi impossibile per ordinare fisso, macchiato embrioni omozigoti mutanti da equilibrato scorte terzo cromosoma utilizzando actina-GFP o armadillo (braccio)-GFP bilanciatori. In secondo luogo, è abbastanza tempo per generare dissezioni fisso di alta qualità. 10-15 per ora è circa veloce quanto la maggioranza delle persone può fare questo. In terzo luogo, alcuni anticorpi non si colorano bene in dissezioni fisso, sia perché gli epitopi degli anticorpi sono sensibili a risolvere, o perché un anticorpo che le macchie di entrambe le strutture interne ed esterne è "assorbito" da parte delle strutture esterne e non penetra a strutture interne ( ad esempio, gli anticorpi contro fasciclin III (Fas3)). Quarto, colorazione vivere con proteine ​​di fusione del recettore per rilevare l'espressione ligando non può essere fatto su preparati fissati.

Dal 2002, il nostro gruppo ha condotto deficit (Df) e schermi espressione ectopica di identificare ligandi RPTP. Per fare questo, abbiamo sviluppato protocolli ottimizzato per la dissezione dell'embrione dal vivo e colorazione delle collezioni che contengono centinaia di linee bilanciate. Colorazione per ligandi del recettore orfano con proteine ​​di fusione del recettore è una domanda specializzata che non è impiegato da molti gruppi. Tuttavia, molti gruppi usano colorazione degli anticorpi di filetti di visualizzare fenotipi embrionale. Attraverso il nostro sviluppo di questi metodi, abbiamo concluso che è molto più efficiente per esaminare fenotipi in grandi collezioni di scorte da dissezione dal vivo che da dissezione fisso. Abbiamo usato la dissezione dal vivo per caratterizzare motore assone, CNS, e fenotipi muscolo in più di 600 DFS, e hanno caratterizzato anche fenotipi del sistema nervoso prodotto dalla espressione ectopica di più di 400 superficie della cellula differente e proteine ​​secrete (AW et al in preparazione.; HK. L. et al., in preparazione).

I protocolli di dissezione dal vivo che abbiamo usato sono evoluti nel corso degli anni. Uno degli autori (KZ) è stato introdotto per vivere dissezione più di 20 anni fa da Nipam Patel, che allora era uno studente laureato nel laboratorio di Corey Goodman. In anni più recenti, abbiamo utilizzato questo metodo per macchiare il SNC con anti-Fas3 [2], ma dissezioni impiegati fissi per tutti gli altri esperimenti. Nel 1999, Aloisia Schmid, poi un postdoc nel nostro gruppo, ha introdotto a vivere dissezione con aghi di vetro, che ha usato per esaminare fenotipi a doppio filamento di RNA-iniettato embrioni [3, 4]. Quando abbiamo cominciato a fare il ligando RPTP schermi pochi anni dopo, abbiamo modificato la sua protocolli per consentire l'analisi rapida di grandi collezioni di scorte mantenuto per bilanciatori GFP. Abbiamo scoperto che GFP-negativi embrioni possono essere facilmente ordinati dalla GFP bilanciato le scorte, anche quando non vi è sostanziale espressione GFP materna (ad esempio per il bilanciatore TM3armGFP), perché gli embrioni sono ordinati dal vivo e sottili differenze nell'espressione GFP può essere facilmente rilevato. Nostro schermo Df successo per un ligando Lar è descritto in [5].

Utilizzando i nostri protocolli attuali, un singolo individuo addestrato può schermo le righe 5-10 al giorno per fenotipi, esaminando 4-7 embrioni mutanti da ogni riga sotto un microscopio composto. Dopo aver selezionato gli embrioni ed arraying, ci vuole circa un'ora per sezionare 50 embrioni. Questo metodo ci permette di identificare mutazioni conferimento sottile, a bassa penetrazionefenotipi nce, dal momento che fino a 70 hemisegments per linea sono segnati a forte ingrandimento 40X con un acqua-immersion lente. Fenotipi quali sarebbe difficile o impossibile da individuare negli schermi di tutto macchiato di montaggio degli embrioni sotto un microscopio da dissezione.

Abbiamo definito un kit per lo screening fenotipico Df che contiene circa 250 righe e rappresenta circa la metà del genoma (AW et al., In preparazione). Lo sviluppo di questo kit è stato avviato come parte del nostro schermo del Df Bloomington kit come esisteva nel 2002-2003 per i geni necessari per la sintesi del ligando RPTP [5]. Nel corso di questa schermata, abbiamo sostituito Bloomington DFS kit per i quali Df / Df omozigoti non ha elaborato un sistema nervoso centrale (e quindi non potevano essere sottoposti a screening per ligando espressione CNS) con i più piccoli Dfs, preferibilmente molecolare mappati, che aveva un migliore sviluppo.

Df / Df omozigoti dalle linee nel nostro kit di screening fenotipico sono normali morfologie generale in fase di 16, permettendo un investigatore per lo screening sistematico per i geni che influenzano lo sviluppo del sistema nervoso centrale, del SNP, le fibre muscolari, la rete tracheale, e molti altri tessuti. Qualsiasi struttura, pattern di espressione, o il motivo localizzazione subcellulare che è visualizzabile con un anticorpo specifico o marcatore GFP nelle fasi 14-16 possono essere sottoposti a screening per fenotipi utilizzando questo kit. Ciò significa che, utilizzando il protocollo qui descritto, una spesa per persona circa la metà della sua / il suo tempo su questo progetto potrebbe sistematicamente schermo la metà di tutti i geni della Drosophila per ogni fenotipo desiderato embrionale entro sei mesi ad un anno.

A. Drosophila di raccolta degli embrioni

1. Preparare "Five-Barrel" camere di raccolta uova

Queste camere di risparmiare tempo e fatica in sede di esame un gran numero di linee di volo.

1. Disporre 50mL cinque provette coniche a testa in giù su una parte inferiore di una x 100 15 millimetri Petri piatto di plastica e la colla insieme usando i tubi in gomma di silicone sigillante adesivo.
2. Una volta che la colla è indurita, colla nella parte inferiore della scatola di Petri sulle estremità coniche dei tubi. Cinque tubi conici rimarrà all'interno della scatola di Petri.
3. Utilizzando un ago caldo, fare buchi nei tubi per la circolazione dell'aria.

2. Preparare piatti raccolta delle uova

1. Versare circa 7 ml di gel di agar uva (1%) in ogni x 100 15 millimetri Petri piatto di plastica. Lo spessore ideale del gel è di circa 3-4 mm per sigillare ogni tubo conico e di fornire l'umidità per 24 ore. Se il gel è troppo spesso, potrebbe cadere quando cambiamo la piastra.
2. Dopo raffreddare i piatti gel, coprire e mettere questi in originale sacchetto di plastica piastra di Petri. Sigillarlo ermeticamente e conservare a 4 ° C.

3. Preparare vola

1. Al fine di ottenere abbastanza uova per una facile selezione di embrioni di fase corretta, cerchiamo di mettere> 50 vergini in una croce, insieme con> 20 maschi.
2. Se una croce è quella di essere sottoposti a screening, mescolare le mosche maschio e femmina e conservare in un flacone di volare cibo con un sacco di pellet di lievito secco sul fondo e una striscia di carta sottile (10 x 100 mm, piegato a metà), piantato in mezzo il cibo. La striscia di carta offrirà una superficie di più e mantenere le mosche da umidità eccessiva.
3. Tenere i flaconcini con le mosche a temperatura ambiente per almeno 3 giorni.
4. Se un titolo da una bottiglia è di essere sottoposti a screening, è sufficiente trasferire vola nella camera di raccolta.

4. Trasferimento vola camere uovo cinque barile collezione.

1. Etichettare il ogni barile di camere di raccolta delle uova.
2. Mettere pasta lievito su una piastra di uovo di raccolta per ogni barile.
3. Preparare 20 pollici etichettatura lungo nastro di tenere la camera e la piastra di assieme. Piega 10 mm di ogni estremità di un cambiamento piatto facile.
4. Iniettare gas CO ₂ nei flaconcini volo e trasferire le mosche nelle botti etichettati.
5. Coprire la camera con il piatto delle uova e premere verso il basso.
6. Nastro intorno alla camera e la piastra insieme a partire dalla metà di piastra di agar. Il nastro si sovrappongono sul piatto la raccolta delle uova.

5. Raccogliere gli embrioni

1. Preparare collezione di piatti all'uovo: pasta di lievito Mettete su un piatto di uova di raccolta per ogni barile.
2. Toccare giù le mosche nelle camere di raccolta delle uova e rimuovere il nastro intorno alla camera di consiglio (Tenere la piastra vecchio stretto).
3. Tocca di nuovo giù le mosche e sostituire la piastra vecchio con uno nuovo.
4. Raccogliere gli embrioni in posizione inclinata per 2-4 ore.
5. Sostituire la piastra di raccolta delle uova al momento desiderato.

6. Età embrioni

Posizionare la piastra di raccolta delle uova a testa in giù su una piastra di Petri coperta di carta bagnati 90 millimetri cerchio filtro e mantenere alla temperatura desiderata. Per dissezioni di scena 16 embrioni da equilibrato linee mutanti, di solito fanno una collezione in tarda mattinata, poi incubare gli embrioni perr> 22 ore a 19 ° C. Per guadagno di funzione studi utilizzando i UAS/GAL4 sistema, raccogliamo gli embrioni a temperatura ambiente nel pomeriggio e incubare per 16 ore a 19 ° C. Il giorno dopo abbiamo trasferire gli embrioni a 29 ° C incubatore per attivare il sistema UAS/GAL4 per 1 o 2 ore. Dopo questo periodo di tempo, gli embrioni sono per lo stadio 15, e questo permette abbastanza tempo per risolvere embrioni per la GFP e metterli in fila, in modo che essi saranno in scena 16 quando la dissezione è fatto.

7. Messa in scena degli embrioni e la selezione per l'espressione della GFP.

Di discriminare i genotipi di embrioni, usiamo bilanciatori GFP. Si esaminano gli embrioni dechorionated sul doppio bastone nastro (vedere la sezione successiva) sotto un GFP Olympus dissezione portata, e li abbiamo selezionati per età e di espressione della GFP, allo stesso tempo.

a) GFP ordinamento:

1. Il bilanciatore del cromosoma 2 che usiamo (CyOarmGFP) ha GFP guidato dal promotore armadillo, che si esprime in tutto l'ectoderma. Eterozigoti CyOarmGFP sono di colore verde oliva, e gli omozigoti CyOarmGFP sono di colore verde brillante. In un magazzino CyoarmGFP, gli embrioni che non hanno il bilanciatore sono facilmente distinguibili, perché non hanno quasi nessuna espressione GFP (assomigliano embrioni da uno stock senza bilanciatore GFP).
2. Il bilanciatore del cromosoma 3 (TM3armGFP) è più difficile da utilizzare per l'ordinamento, perché è espressione della GFP più maternamente guidato. Come risultato, gli embrioni sono divisi in categorie più o meno verdi. Con una certa pratica, di solito è semplice per ordinare gli embrioni di meno e più verde l'uno dall'altro, ma è anche necessario ricorrere them dal clustering di loro e individuando gli embrioni occasionali che sono più verde rispetto alle altre (eterozigoti TM3armGFP) dopo il trasferimento alla piastra di agar. Altrimenti, ci saranno sicuramente alcuni embrioni che sono del genotipo errato.
3. Il bilanciatore X è FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Ciò è espresso in un tessuto specifico modello. I modelli che sono rilevanti per l'ordinamento nelle fasi 15-16 sono i amnioserosa e due punti di espressione in testa, che sono cellule di organi del Bolwig è. Purtroppo, nella fase in cui si vuole per ordinare gli embrioni, la amnioserosa sta svanendo e gli organi del Bolwig non hanno ancora iniziato a brillare. E 'quindi necessario guardare molto attentamente gli embrioni sul nastro, spesso li ribaltamento, di segnare loro per GFP, ed è essenziale ricorrere loro sulla piastra di agar. Di solito lo facciamo due volte: una volta subito dopo averlo spostato tutti gli embrioni dal nastro alla piastra, e di nuovo dopo l'invecchiamento al momento opportuno, appena prima di loro rivestimento in preparazione per la dissezione. A volte, abbiamo anche riesaminare la diapositiva nell'ambito di applicazione GFP dopo il trasferimento degli embrioni alla piscina PBS (vedi sotto), perché la visualizzazione di GFP è meglio in queste condizioni. Poi, siamo in grado di distruggere gli embrioni che hanno GFP appena prima di iniziare la dissezione.

b) Stadiazione

Lo strumento principale per la stadiazione embrioni intorno st. 14-16 è morfologia intestinale. L'intestino si illumina con autofluorescenza nell'ambito di applicazione GFP. Prima di tentare di embrioni fase, si dovrebbe fare riferimento ai libri o siti che hanno immagini e diagrammi degli embrioni (per esempio la Hartenstein e Campos-Ortega libro verde), in modo che si capisce quello che dovrebbe essere simile. Il palcoscenico ideale per la dissezione si ha quando l'intestino è diviso in tre fasce. Prima di questo, l'intestino appare come un blob singolo. Una sorta spesso embrioni allo stadio di blob e poi loro età fino a raggiungere il miglior palcoscenico per la dissezione. Dopo le tre bande fase, l'intestino inizia a sviluppare le bande diagonali vicino alla coda, e poi le bobine, e l'embrione diventa più chiaro. Entro tale termine, l'embrione diventa difficile sezionare perché non si attacchi sul vetrino. Se si vuole sezionare stadio avanzato stadio 16/early 17 embrioni, è necessario analizzare e valutare molti embrioni che morfologie intestinali sono associati con embrioni che bastone o non bastone. Questo varia in qualche modo tra i genotipi pure.

B. Drosophila dissezione dell'embrione dal vivo

1. Embrione dechorionation
   1. Preparare nastro biadesivo adesivo e la piastra di lastra d'uva su una diapositiva
   2. Trasferire gli embrioni di età compresa tra il piatto delle offerte ai due lati del nastro adesivo utilizzando un pennello umido. Diffondere gli embrioni in modo uniforme.
   3. Dechorionate gli embrioni sul nastro biadesivo appiccicoso tirando loro tutto delicatamente con un ago smussato dissezione. Dopo dechorionation, gli embrioni si attacca più fortemente alla fine dell'ago piuttosto che altri embrioni o al corion, ma non tanto quanto al nastro; così si rotola gli embrioni in cima al corion o su altri embrioni, poi solleva si spegne e si trasferisce alla lastra lastra d'uva. La genotipizzazione e la messa in scena (vedi sopra per la descrizione dettagliata) è fatto durante il processo di dechorionation etrasferimento al ago.
   4. Dopo il ricorso per il genotipo e l'età, spostare gli embrioni ad una piccola lastra rettangolare di agar, di larghezza sufficiente per consentire la fila di 10-15 embrioni di fila. Allineare gli embrioni dechorionated su questa lastra: parte dorsale giù contro le estremità agar lastra e posteriore rivolto verso di voi. Di solito le righe di embrioni 5-10.
2. Preparare un vetrino e il trasferimento degli embrioni per la dissezione dal vivo
   1. Tagliare un piccolo pezzo rettangolare di nastro biadesivo appiccicoso e posizionarlo vicino a una delle estremità del Super Frost / Plus. diapositive (Fisher Scientific, Cat # 12-550-15).
   2. Disegnare un rettangolo (lungo 30-40 mm, e l'intera larghezza della diapositiva) intorno il nastro con una penna di cera, in modo che ci sia ~ 3 mm di spazio tra la cera e nastro (Super Pen Pap HT, www.rpicorp. com ) e trasferire gli embrioni dalla lastra lastra d'uva al nastro, invertendo la diapositiva e delicatamente abbassare sulla embrioni, in modo che il nastro viene a contatto con la allineati-up embrioni (fatto in un ambito di dissezione). Gli embrioni devono essere allineati in modo che l'estremità posteriore è verso di voi. Essi saranno ora la parte dorsale della diapositiva.
   3. Aggiungere immediatamente 1X PBS (ricetta Gibco) negli embrioni per riempire il rettangolo di cera.
3. Embrione dissezione dal vivo
   1. Usando un ago dissezione di vetro (a base di un ago da iniezione), tagliare lungo la linea mediana dorsale, a partire dalla fine posteriore dell'embrione.
   2. Poke all'estremità anteriore dell'embrione, sollevare e trasferire l'embrione alla diapositiva fino a quando si attacca. Mantenere gli embrioni nel buffer. Fate una fila ordinata di embrioni sulla diapositiva che corrisponde a ogni riga sulla lastra agar. Organizzare le righe in modo che possano stare su tutte le diapositive.
   3. Ci sono una serie di sequenze dissezione possibili che possono essere utilizzate nella generazione di filetti. La gente di solito sviluppare le proprie procedure ottimizzate attraverso il fare gli stessi dissezioni. Il video mostra una sequenza in cui si fa un piccolo taglio alla fine posteriore dell'embrione per separare i due lati della parete del corpo le une dalle altre. Se lo si desidera, si può anche rompere la midgut / hindgut connessione con questo taglio, e spostare il hindgut fuori sul vetrino in questo momento (nel video, lo spostamento hindgut è fatto più tardi). Poi, i tagli sono fatti su ogni lato posteriore solo per i lobi del cervello al fine di separare le pareti del corpo dal cervello. A seconda dell'età degli embrioni, si può anche bisogno di fare un taglio superficiale lungo la linea mediana dorsale di tagliare la connessione amnioserosal tra le pareti del corpo.
   4. Poi, con delicatezza pasta verso il basso i lembi della parete del corpo sul vetrino, evitando che si estende loro o rimuovere il materiale dalla loro superficie. Questo è fatto meglio consentendo solo l'ago a contattare gli angoli anteriori e posteriori ai bordi della parete dorsale del corpo. Il assoni motori non si estendono fino a questo punto dorsalmente, così nel migliore dei casi questo produrrà un embrione con filiali ISN completamente intatto. In alcuni casi l'ISN verrà troncato, anche con la tecnica migliore, perché l'embrione non sempre separati esattamente lungo la linea mediana dorsale. Se fatto correttamente, questo metodo preservare le strutture del corpo in segmenti di muro T3-A6 (circa).
   5. Si può lasciare il midgut sopra l'embrione, e quindi rimuoverlo da tutti gli embrioni sezionati dopo aver terminato tutte le dissezioni. Questo viene fatto colpendo l'intestino, spostando lontano da l'embrione, e stretching a rompere il suo collegamento con la foregut, che si trova sotto i lobi del cervello. Oppure, si può rimuovere l'intestino da ogni dissezione come uno che completa. Con i mutanti che hanno uno sviluppo anormale dell'intestino, è un vantaggio per rimuovere tutte le budella in una volta dopo aver finito la dissezione, perché tuorlo rilasciato dall'intestino può rendere più difficile attaccare gli embrioni trasferiti in seguito, alla diapositiva dopo il trasferimento dal nastro doublestick . A volte è utile per trasferire gli embrioni a partire dalla parte inferiore della diapositiva (verso di sé), piuttosto che nella parte superiore, come tuorlo tende a diffondersi verso di sé a causa dei movimenti tipici del ago.
4. Fissazione e immunofluorescenza / immunoistochimica
   1. A questo punto, si può risolvere immediatamente gli embrioni, se uno è colorazione con anticorpi, o si può togliere il PBS e sostituirlo con surnatante proteina di fusione, se si sta facendo un esperimento dal vivo colorazione per rilevare l'espressione ligando. Questo aspetto di questo esperimento è descritto in dettaglio nel Metodi e metodi supplementari sezioni di rif. [5].
   2. Qui si descrive il protocollo di fissazione, che è fatto immediatamente o dopo la colorazione proteina di fusione. Usando due pipette Pasteur, sostituire la PBS con 5% paraformaldeide in PBS (EMS, cat. # 15713-S, www.emsdiasum.com). Scambio in soluzione fissare tre volte, che implica l'utilizzo di ~ 6 ml di soluzione correzione, dato che detiene una pipetta Pasteur1,5-2 ml di soluzione. Fix per 45 '.
   3. Rimuovere fissare soluzione, sostituire con PBS (3 modifiche), poi con PBT (PBS + 0,1% Triton X-100 + 1 mg / ml BSA Frazione V, 3 modifiche), quindi sostituire PBT con ~ 200 microlitri soluzione di blocco (PBT + 5 trattato termicamente% siero normale di capra), poi con l'anticorpo desiderato primario nella soluzione di blocco. E 'molto importante per non permettere il menisco a contattare gli embrioni, in particolare mentre sono in PBS, in modo da distruggere il dissezioni. Dopo detergente viene aggiunto gli embrioni diventano meno sensibili al menisco. Così, si può sostituire il PBT con blocco inclinando il vetrino e assorbente via la maggior parte della soluzione toccando un Kimwipe brevemente un angolo della zona delimitata dalla cera. Lo stesso metodo può essere utilizzato per sostituire il blocco con il corpo contro la soluzione. Questo riduce al minimo riporto di soluzioni.
   4. Incubare per una notte a 4 ° C, quindi lavare 3X con PBT (> 15 minuti / lavaggio) in un vassoio su una piattaforma oscillante (assicurarsi che non vi sia sufficiente PBT in modo che la diapositiva è sempre completamente immerso durante dondolo), reblock come descritto sopra, aggiungere 200 microlitri anticorpo secondario, incubare 2 ore. a RT, rewash con PBT. Controllare colorazione (se fluorescenza verde è utilizzato) se lo si desidera sotto la GFP dissezione portata.
   5. Lavare 2X con PBS (5 '), poi aggiungere 500 microlitri 70% glycerol/1X PBS (fatto mescolando 35 glicerolo ml, 5 ml di PBS 10X e 10 ml di acqua in un tubo da 50 ml), e chiara notte a 4 ° C (o per 2 ore a temperatura ambiente). Rimuovere glicerolo e messo su un # 1 coprioggetto.

Discussion

Ci auguriamo che questa dimostrazione video ha mostrato i nostri metodi per la dissezione dell'embrione dal vivo e colorazione in modo sufficientemente dettagliato che adesso possono essere facilmente eseguito da una persona che ha una certa esperienza in Drosophila genetica e dell'embriologia. Naturalmente, la pratica considerevole sarà ancora necessaria, soprattutto per gli stessi dissezioni. Nella nostra esperienza, ogni persona che impara i metodi di dissezione dal vivo crea un protocollo di dissezione sottilmente diverso che permette lui / lei a generare la maggior parte schierati rapidamente dissezioni di alta qualità. Questo processo richiede mesi di pieno sviluppo. Tuttavia, la maggioranza delle persone in grado di generare alta qualità dissezioni dopo poche settimane di pratica.

Anche se abbiamo favorire l'utilizzo di dissezioni dal vivo per lo screening, non possono sostituire dissezioni fisso, perché i protocolli dissezione fisso può essere applicato a una gamma più ampia di stadi embrionali. Per esempio, nell'analisi del nostro kit per il motore Df fenotipi guida degli assoni, abbiamo scoperto che i dettagli del motore sedi assone, tra cui filopodia, possono essere meglio visibili con la colorazione di immunofluorescenza filetti di vivere che dalle tradizionali perossidasi di rafano (HRP) visualizzazione immunoistochimica di filetti fissa (per gli esempi di alta qualità colorazione HRP, vedere il fondo di orientamento degli assoni motori laboratorio sulla nostra pagina web). Tuttavia, gli embrioni più anziani che l'inizio della fase 17 non si attacchi alle SuperFrost Plus. diapositive dovute alla loro evoluzione della cuticola. Così, per l'analisi quantitativa dei fenotipi per filiali motore tardo-sviluppo dell'assone come il SNA, abbiamo ancora contare su dissezioni fisso (AW et al., In preparazione).

Allo stato attuale, questi metodi sono stati applicati soltanto per alcuni problemi del nostro gruppo. Questi includono l'identificazione e l'analisi fenotipica di nuovi geni coinvolti nel sistema nervoso centrale e di guida degli assoni motori, l'identificazione di ligandi del recettore orfano, e l'identificazione di geni necessari per la sintesi di epitopi riconosciuti da anticorpi monoclonali specifici. Tuttavia, molte altre applicazioni possono essere immaginato, soprattutto quando questi metodi sono combinati con l'analisi del nostro kit Df e raccolta espressione ectopica o di collezioni generati da altri ricercatori. Per esempio, dovrebbe essere possibile per lo screening sistematico per i geni necessari per la sintesi, pattern di espressione cellulare, o la localizzazione subcellulare di proteine ​​che possono essere rilevati da una elevata qualità anticorpo o un reporter GFP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate Tubing With Filament	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Narishige model PC-10 needle puller	Narishige International		Tubes pulled using a heater level of 58.9