Summary
हम विशिष्ट जीनोटाइप का ड्रोसोफिला भ्रूण की "पट्टिका" तैयारी पैदा करने के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक स्क्रीन की एक किस्म के कुशल निष्पादन की अनुमति देता है. यह भी देर से भ्रूण में संरचनाओं के उत्कृष्ट दृश्य की अनुमति देता है.
Abstract
ड्रोसोफिला भ्रूण भ्रूण विकास के 14 और 17 चरणों के बीच आसानी से हो "पट्टिका" तैयारी उत्पन्न विच्छेदित कर सकते हैं . इन तैयारियों में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के बीच नीचे चलाता है, और शरीर की दीवारों द्वारा flanked है. कई अलग अलग phenotypes ऐसी तैयारी का उपयोग कर जांच की गई है. ज्यादातर मामलों में, fillets एंटीबॉडी से सना हुआ तय पूरे माउंट भ्रूण के विच्छेदन के द्वारा उत्पन्न किया गया. "ये तय dissections" कुछ नुकसान है, लेकिन. वे निष्पादित करने के लिए समय लेने हैं, और यह मुश्किल है के शेयरों में जो परिवर्तन GFP balancer के गुणसूत्रों से अधिक रखा जाता है से उत्परिवर्ती भ्रूण (GFP नकारात्मक) सॉर्ट है. 2002 के बाद से, हमारे समूह की कमी और अस्थानिक अभिव्यक्ति स्क्रीन आयोजन किया गया है अनाथ रिसेप्टर्स के लिए ligands की पहचान. आदेश में यह करने के लिए, हम रहते भ्रूण विच्छेदन और संतुलित लाइनों के सैकड़ों युक्त संग्रह के एंटीबॉडी धुंधला के लिए सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल विकसित किया है. हम यह निष्कर्ष निकाला है कि यह काफी अधिक कुशल है तय विच्छेदन के द्वारा की तुलना में रहते विच्छेदन के द्वारा शेयरों के बड़े संग्रह में phenotypes की जांच. प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित का प्रयोग, एक एकल प्रशिक्षित व्यक्ति phenotypes के लिए प्रति दिन 10 लाइनों, प्रत्येक पंक्ति से एक यौगिक खुर्दबीन के तहत 4-7 उत्परिवर्ती भ्रूण की जांच करने के लिए स्क्रीन कर सकते हैं. यह सूक्ष्म, कम penetrance phenotypes प्रदान म्यूटेशनों, के बाद से प्रति पंक्ति 70 hemisegments उच्च वृद्धि पर एक 40x लेंस पानी विसर्जन के साथ रन बनाए हैं की पहचान की अनुमति देता है.
Protocol
परिचय
ड्रोसोफिला भ्रूण भ्रूण विकास के 14 और 17 चरणों के बीच आसानी से हो "पट्टिका" तैयारी उत्पन्न विच्छेदित कर सकते हैं . इन तैयारियों में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) के बीच नीचे चलाता है, और शरीर की दीवारों द्वारा flanked है. पेट हटा दिया है. जब एंटीबॉडी के साथ दाग, fillets सीएनएस और शरीर दीवार संरचनाओं (जैसे मोटर axons, मांसपेशियों, परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स (पीएन), tracheae) की तुलना में बहुत बेहतर दृश्य पूरे माउंट भ्रूण की अनुमति है, क्योंकि वहाँ कोई तैयारी और बीच बीच ऊतक है coverslip, और क्योंकि fillets फ्लैट कर रहे हैं, संरचनाओं है कि शरीर की दीवार के पार का विस्तार एक एकल नाभीय विमान में visualized किया जा करने के लिए अनुमति. कई अलग अलग phenotypes ऐसी तैयारी का उपयोग कर जांच की गई है. ज्यादातर मामलों में, fillets तय, एंटीबॉडी दाग पूरे माउंट भ्रूण के विच्छेदन के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. ये तय तैयारी निम्न चरणों का पालन द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं:) 3 मेथनॉल के साथ vitelline झिल्ली हटाने; 4) एंटीबॉडी immunohistochemistry या immunofluorescence का उपयोग धुंधला; 2 / paraformaldehyde हेपटैन) के साथ नियतन 5) ग्लिसरॉल में समाशोधन, 1) ब्लीच के साथ chorion हटाने 6) टंगस्टन सुइयों के साथ विच्छेदन. इन "तय dissections" धुंधला के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल रेफरी में प्रदान की जाती हैं. [1].
फिक्स्ड dissections कुछ नुकसान है, लेकिन. सबसे पहले, यह अक्सर मुश्किल होता है के लिए तय, दाग (GFP नकारात्मक) उत्परिवर्ती शेयरों या पार से भ्रूण में जो परिवर्तन GFP balancers पर संतुलित कर रहे हैं, तब भी जब विरोधी GFP का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है सॉर्ट है. यह GFP की मातृ अभिव्यक्ति सहित कारकों की एक किस्म की वजह से है. उदाहरण के लिए, हमने पाया है कि यह लगभग असंभव है संतुलित तीसरे गुणसूत्र या तो actin GFP या armadillo (हाथ) GFP balancers का उपयोग शेयरों से तय, दाग homozygous उत्परिवर्ती भ्रूण तरह. दूसरा, यह काफी समय लेने वाली है के लिए उच्च गुणवत्ता तय dissections उत्पन्न. प्रति घंटे 10-15 के बारे में के रूप में तेजी के रूप में अधिकांश लोगों को इस कर सकते हैं. तीसरा, कुछ एंटीबॉडी अच्छी तरह से तय dissections में नहीं दाग करते हैं, क्योंकि या तो एंटीबॉडी epitopes ठीक करने के लिए संवेदनशील हैं, या क्योंकि एक एंटीबॉडी दाग है कि दोनों आंतरिक और बाहरी संरचना "ऊपर लथपथ" बाहरी संरचनाओं द्वारा और आंतरिक संरचना के लिए घुसना नहीं ( fasciclin III (Fas3)) के खिलाफ जैसे एंटीबॉडी . चौथा, संलयन प्रोटीन रिसेप्टर के साथ जीना धुंधला ligand अभिव्यक्ति का पता लगाने तय तैयारी पर नहीं किया जा सकता है.
2002 के बाद से, हमारे समूह (df) की कमी और अस्थानिक अभिव्यक्ति स्क्रीन का आयोजन RPTP ligands की पहचान. आदेश में यह करने के लिए, हम रहते भ्रूण और संतुलित लाइनों के सैकड़ों युक्त संग्रह के विच्छेदन धुंधला के लिए सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल विकसित किया है. धुंधला रिसेप्टर संलयन प्रोटीन के साथ अनाथ रिसेप्टर ligands के लिए एक विशेष अनुप्रयोग है कि कई समूहों द्वारा नियोजित नहीं है. हालांकि, कई समूहों fillets के धुंधला एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए भ्रूण phenotypes कल्पना. इन तरीकों के बारे में हमारी विकास के माध्यम से, हम यह निष्कर्ष निकाला है कि यह काफी अधिक कुशल है तय विच्छेदन के द्वारा की तुलना में रहते विच्छेदन के द्वारा शेयरों के बड़े संग्रह में phenotypes की जांच. हम रहते विच्छेदन का इस्तेमाल किया है 600 से अधिक DFS में मोटर अक्षतंतु, CNS, और मांसपेशियों phenotypes विशेषताएँ, और भी तंत्रिका तंत्र phenotypes 400 से अधिक विभिन्न कोशिका की सतह के अस्थानिक अभिव्यक्ति और secreted (प्रोटीन की तैयारी में ऐडवर्ड्स एट अल द्वारा उत्पादित होती है. एच. एल एट अल, तैयारी में).
जीना विच्छेदन प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है हम पिछले कुछ वर्षों में विकसित किया है. (KZ) लेखकों की पहली विच्छेदन Nipam पटेल, जो तब कोरी गुडमैन प्रयोगशाला में एक स्नातक छात्र था द्वारा अधिक से अधिक 20 साल पहले रहने के लिए पेश किया गया था. अधिक हाल के वर्षों में, हम इस पद्धति का इस्तेमाल किया विरोधी Fas3 [2], लेकिन अन्य सभी प्रयोगों के लिए कार्यरत तय dissections के साथ सीएनएस दाग. 1999 में, Aloisia Schmid, तो हमारे समूह में एक postdoc, हमें गिलास सुई, जो वह डबल शाही सेना के इंजेक्शन भ्रूण [3, 4] असहाय में phenotypes इस्तेमाल की जांच के साथ विच्छेदन जीने के लिए शुरू की. जब हम RPTP ligand स्क्रीन कर एक कुछ वर्षों के बाद शुरू हुआ, हम उसके प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए GFP balancers से अधिक बनाए रखा शेयरों के बड़े संग्रह के तेजी से विश्लेषण की अनुमति है. हमने पाया कि GFP-नकारात्मक भ्रूण आसानी GFP संतुलित शेयरों से हल किया जा सकता है जब भी वहाँ पर्याप्त मातृ GFP अभिव्यक्ति (TM3armGFP balancer के लिए जैसे) है, क्योंकि भ्रूण हल कर रहे हैं GFP अभिव्यक्ति में रहते हैं और सूक्ष्म अंतर को आसानी से पता लगाया जा सकता है. हमारे एक ligand Lar के लिए सफल df स्क्रीन [5] में वर्णित है.
हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल का प्रयोग, एक एकल प्रशिक्षित व्यक्ति phenotypes के लिए प्रति दिन 5-10 लाइनों, प्रत्येक पंक्ति से एक यौगिक खुर्दबीन के तहत 4-7 उत्परिवर्ती भ्रूण की जांच स्क्रीन कर सकते हैं. चयन और arraying भ्रूण के बाद, यह के बारे में एक घंटे लेता है 50 भ्रूण काटना. इस विधि हमें सूक्ष्म, कम penetra प्रदान म्यूटेशनों की पहचान करने की अनुमति देता हैnce phenotypes, प्रति पंक्ति 70 hemisegments के बाद से उच्च वृद्धि पर एक 40x लेंस पानी विसर्जन के साथ रन बनाए हैं. ऐसे phenotypes मुश्किल या असंभव दाग पूरे माउंट भ्रूण की स्क्रीन में एक विदारक खुर्दबीन के नीचे का पता लगाने के लिए होगा.
हम प्ररूपी स्क्रीनिंग के बारे में 250 लाइनें शामिल हैं और जीनोम के बारे में आधे (ऐडवर्ड्स एट अल. तैयारी में) का प्रतिनिधित्व करता है के लिए एक df किट परिभाषित किया है. इस किट के विकास ब्लूमिंगटन df किट के हमारे स्क्रीन के एक भाग के रूप में शुरू हो गया था के रूप में यह RPTP ligand [5] संश्लेषण के लिए आवश्यक जीनों के लिए वर्ष 2002-2003 में अस्तित्व. इस स्क्रीन के पाठ्यक्रम में, हम ब्लूमिंगटन किट DFS जगह है जिसके लिए df / df homozygotes छोटे DFS के साथ एक (और इसलिए सीएनएस ligand अभिव्यक्ति के लिए जांच नहीं हो सकता है) CNS, अधिमानतः molecularly प्रतिचित्रित है कि बेहतर विकास किया था विकसित नहीं किया.
हमारे प्ररूपी स्क्रीनिंग किट में लाइनों से df / df homozygotes 16 चरण में सामान्य समग्र morphologies है, CNS, पीएन, मांसपेशी फाइबर, tracheal नेटवर्क, और कई अन्य ऊतकों के विकास को प्रभावित करने वाले जीनों के लिए व्यवस्थित स्क्रीन करने के लिए एक अन्वेषक की अनुमति है. कोई संरचना, अभिव्यक्ति पैटर्न, या subcellular स्थानीयकरण पैटर्न है कि एक विशिष्ट एंटीबॉडी या 14-16 चरणों में GFP मार्कर के साथ visualizable है इस किट का उपयोग कर phenotypes के लिए जांच की जा सकती है. इसका मतलब यह है कि प्रोटोकॉल का उपयोग यहाँ वर्णित है, उसके आधे / इस परियोजना पर उसे समय के बारे में एक व्यक्ति खर्च में योजनाबद्ध तरीके से किसी भी वांछित भ्रूण phenotype के लिए एक वर्ष के लिए छह महीने के भीतर सभी ड्रोसोफिला जीनों के आधे स्क्रीन सकता है.
ए ड्रोसोफिला भ्रूण संग्रह
1. "पाँच बैरल" अंडा संग्रह कक्षों तैयार
इन कक्षों समय और प्रयास को बचाने के लिए जब उड़ लाइनों की एक बड़ी संख्या की जांच.
- पांच 50ml शंक्वाकार ट्यूबें ऊपर एक 100 x 15 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश और गोंद ट्यूबों के साथ सिलिकॉन रबर चिपकने वाला सीलेंट का उपयोग के नीचे हिस्से पर व्यवस्थित नीचे.
- एक बार कठोर गोंद, गोंद ट्यूबों के शंक्वाकार छोर पर पेट्री डिश के निचले भाग. पांच शंक्वाकार ट्यूबों पेट्री डिश के अंदर खड़े होंगे.
- एक गर्म सुई का प्रयोग, ट्यूबों में हवा परिसंचरण के लिए छेद बना.
2. अंडे संग्रह प्लेटों की तैयारी
- अंगूर अगर जेल (1%) के बारे में 7mL प्रत्येक 100 x 15 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में डालो. जेल के आदर्श 3-4 करने के लिए प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब मुहर और 24 घंटे के लिए नमी प्रदान मिमी मोटाई के बारे में है. यदि जेल भी मोटी है, यह नीचे गिर जाते हैं जब हम प्लेट बदलने.
- बाद जेल प्लेटें बंद शांत कवर, और मूल प्लास्टिक पेट्री डिश बैग में इन डाल दिया. बैग कसकर सील और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
3. मक्खियों की तैयारी
- आदेश में सही मंच के भ्रूण के आसान चयन के लिए पर्याप्त अंडे प्राप्त करने के लिए, हम एक क्रॉस में> 50 कुंवारी डाल,> 20 पुरुषों के साथ एक साथ करने की कोशिश है.
- यदि कोई पार करने के लिए जांच की जानी है, नर और मादा मक्खियों मिश्रण और तल पर सूखी खमीर छर्रों की बहुत सारी और एक पतली पट्टी कागज (10 एक्स 100 मिमी, आधे में मुड़ा हुआ) के साथ एक मक्खी भोजन शीशी में रख के बीच में लगाया खाना. कागज पट्टी और अधिक सतह क्षेत्र प्रदान करने और अत्यधिक नमी से मक्खियों रखेंगे.
- आरटी पर मक्खियों के साथ कम से कम 3 दिनों के लिए शीशियों का रखें.
- यदि एक बोतल से एक शेयर के लिए जांच की जानी है, बस संग्रह चेंबर में मक्खियों हस्तांतरण.
4. स्थानांतरण पांच बैरल अंडे संग्रह कक्षों के लिए मक्खियों.
- अंडा संग्रह कक्षों के बैरल प्रत्येक लेबल.
- प्रत्येक बैरल के लिए एक अंडा संग्रह थाली पर खमीर पेस्ट रखो.
- 20 इंच लंबी लेबलिंग टेप तैयार कक्ष और थाली एक साथ पकड़. आसान प्लेट बदलने के लिए प्रत्येक के अंत के 10 मिमी मोड़ो.
- मक्खी शीशियों में सीओ 2 गैस इंजेक्षन और लेबल बैरल में मक्खियों को हस्तांतरण .
- अंडा संग्रह थाली के साथ चैम्बर कवर और नीचे दबाएँ.
- कक्ष और एक साथ थाली अगर प्लेट के बीच में से शुरू के चारों ओर टेप. टेप अंडा संग्रह थाली पर ओवरलैप जाएगा.
5. भ्रूण लीजिए
- अंडे संग्रह की थाली तैयार: प्रत्येक बैरल के लिए एक अंडा संग्रह थाली पर खमीर पेस्ट रखो.
- नीचे अंडे संग्रह कक्षों में मक्खियों ठोकर और कक्षों के आसपास टेप हटाने (पुराने थाली कसकर पकड़ो).
- नीचे मक्खियों फिर ठोकर और एक नए के साथ पुराने प्लेट की जगह.
- 2-4 घंटे के लिए slanted स्थिति में भ्रूण ले लीजिए.
- वांछित समय पर अंडे संग्रह थाली बदलें.
6. आयु भ्रूण
अंडा संग्रह थाली उल्टा गीला 90 मिमी सर्कल फिल्टर पेपर के साथ एक कवर पेट्री थाली पर प्लेस और वांछित तापमान पर रखना. संतुलित उत्परिवर्ती लाइनों से 16 भ्रूण चरण के dissections के लिए, हम आम तौर पर देर सुबह में एक संग्रह करते हैं, तो के लिए भ्रूण सेतेr> 19 में 22 घंटा ° लाभ के समारोह UAS/GAL4 प्रणाली का उपयोग पढ़ाई के लिए सी., हम 19 में दोपहर और 16 घंटा के लिए सेते में आरटी पर भ्रूण डिग्री सेल्सियस इकट्ठा अगले दिन हम एक 29 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर भ्रूण हस्तांतरण के लिए 1 या 2 घंटे के लिए UAS/GAL4 प्रणाली को सक्रिय. समय की इस राशि के बाद, भ्रूण ज्यादातर 15 चरण हैं, और इस GFP अभिव्यक्ति के लिए भ्रूण सॉर्ट और उन्हें लाइन पर्याप्त समय की अनुमति देता है, ताकि वे 16 चरण में जब विच्छेदन किया जाता है.
7. भ्रूण मचान और GFP अभिव्यक्ति के लिए छँटाई.
भ्रूण के जीनोटाइप भेदभाव करने के लिए, हम GFP balancers उपयोग. हम एक ओलिंप गुंजाइश विदारक GFP के तहत डबल छड़ी टेप पर dechorionated भ्रूण जांच (अगले अनुभाग देखें), और हम एक ही समय में उम्र और GFP अभिव्यक्ति के लिए उन्हें चुनें.
एक) GFP छँटाई:
- 2 गुणसूत्र balancer का उपयोग हम (CyOarmGFP) GFP armadillo प्रमोटर, जो बाह्य त्वक स्तर भर में व्यक्त किया है के द्वारा संचालित है. CyOarmGFP heterozygotes जैतून हरा कर रहे हैं, और CyOarmGFP homozygotes चमकीले हरे हैं. एक CyoarmGFP स्टॉक में, भ्रूण कि balancer कमी को आसानी से विशिष्ट हैं क्योंकि वे लगभग कोई GFP अभिव्यक्ति (वे कोई GFP balancer के साथ एक शेयर से भ्रूण की तरह देखो) है.
- 3 गुणसूत्र balancer (TM3armGFP) सॉर्टिंग के लिए उपयोग करने के लिए कठिन है, क्योंकि यह अधिक प्रेरित माता GFP अभिव्यक्ति है. एक परिणाम के रूप में, भ्रूण और अधिक और कम हरी श्रेणियों में विभाजित हैं. कुछ अभ्यास के साथ, यह आमतौर पर एक दूसरे से कम और अधिक हरे भ्रूण तरह सीधा है, लेकिन यह भी आवश्यक है उन्हें उन्हें क्लस्टरिंग और सामयिक भ्रूण है कि और अधिक दूसरों की तुलना में हरी (TM3armGFP heterozygotes) स्थानांतरण के बाद उठा द्वारा सहारा अगर प्लेट. अन्यथा, वहाँ कुछ भ्रूण कि गलत जीनोटाइप के कर रहे हैं सुनिश्चित कर रहे हैं.
- एक्स balancer Fm7 Kr GAL4, यूएएस - GFP है. यह एक ऊतक विशेष पैटर्न में व्यक्त किया है. पैटर्न है कि 15-16 चरणों में छँटाई प्रासंगिक हैं amnioserosa और सिर में अभिव्यक्ति की दो अंक, जो Bolwig अंग कोशिकाओं कर रहे हैं. दुर्भाग्य से, मंच है जहां एक भ्रूण सॉर्ट करना चाहता है, amnioserosa लुप्त होती है और अभी तक Bolwig अंगों चमक के लिए शुरू नहीं किया है. इस प्रकार यह टेप पर भ्रूण पर बहुत ध्यान से देखो, अक्सर उन्हें रोलिंग पर, उन्हें GFP के लिए स्कोर करना आवश्यक है, और यह उन्हें अगर प्लेट पर सहारा आवश्यक है. आमतौर पर हम इस दो बार: एक बार तुरंत थाली करने के लिए टेप से सभी भ्रूण जाने के बाद, और फिर उपयुक्त मंच के लिए उम्र बढ़ने के बाद, बस से पहले उन्हें विच्छेदन के लिए तैयारी में अस्तर. कभी कभी, हम भी भ्रूण के पीबीएस पूल (नीचे देखें) के लिए स्थानांतरण के बाद GFP गुंजाइश के तहत स्लाइड फिर से जांच, क्योंकि GFP के दृश्य इन शर्तों के तहत बेहतर है. फिर, हम भ्रूण कि विच्छेदन शुरुआत से पहले बस GFP है को नष्ट कर सकते हैं.
ख मचान)
स्टंप के आसपास भ्रूण मंचन के लिए प्राथमिक उपकरण. 14-16 पेट आकारिकी है. GFP गुंजाइश तहत autofluorescence के साथ पेट चमकता है. चरण भ्रूण करने का प्रयास करने से पहले, एक संदर्भ किताबें या साइटों है कि चित्रों और भ्रूण के चित्र (Hartenstein और Campos Ortega हरी पुस्तक जैसे) से परामर्श, ताकि एक समझते हैं कि वे क्या तरह दिखना चाहिए चाहिए. विच्छेदन के लिए आदर्श मंच है जब पेट तीन बैंड में विभाजित किया गया है. पहले पेट एक एकल बूँद के रूप में प्रकट होता है. एक बूँद मंच पर अक्सर प्रकार भ्रूण और फिर उन्हें उम्र जब तक वे विच्छेदन के लिए सबसे अच्छा मंच तक पहुँचने. तीन बैंड चरण के बाद, पेट पूँछ के पास विकर्ण बैंड, तो और coils का विकास शुरू होता है, और भ्रूण स्पष्ट हो जाता है. इस अवधि के भीतर, भ्रूण काटना मुश्किल हो जाता है क्योंकि यह गिलास स्लाइड पर नहीं रहना होगा. यदि एक देर मंच 16/early 17 भ्रूण चरण टुकड़े करना चाहता है, यह कई भ्रूण काटना और जो पेट morphologies भ्रूण कि छड़ी या छड़ी नहीं है के साथ जुड़े रहे हैं मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है. इस के रूप में अच्छी तरह से जीनोटाइप के बीच कुछ बदलता है.
बी ड्रोसोफिला भ्रूण रहते विच्छेदन
- भ्रूण dechorionation
- किसी स्लाइड पर डबल पक्षीय चिपचिपा टेप और अंगूर की थाली स्लैब तैयार
- संग्रह थाली से आयु वर्ग के भ्रूण के डबल पक्षीय चिपचिपा टेप का उपयोग कर एक गीला तूलिका के लिए स्थानांतरण. भ्रूण समान रूप से बिखरा हुआ है.
- उन्हें इसे पार पा विदारक सुई के साथ धीरे रोलिंग द्वारा डबल पक्षीय चिपचिपा टेप पर भ्रूण Dechorionate. Dechorionation के बाद, भ्रूण और अधिक दृढ़ता से अन्य भ्रूण के लिए या chorion करने के लिए की तुलना में सुई के अंत तक रहना होगा, लेकिन नहीं के रूप में टेप करने के लिए दृढ़ता से, इस प्रकार chorion के शीर्ष पर या अन्य भ्रूण पर एक भ्रूण रोल, तो लिफ्टों बंद और यह अंगूर प्लेट स्लैब के लिए स्थानान्तरण. जीनोटाइपिंग और मचान (विस्तृत विवरण के लिए ऊपर देखें) dechorionation की प्रक्रिया के दौरान किया जाता है औरसुई के लिए स्थानांतरण.
- जीनोटाइप और उम्र के लिए सहारा के बाद, अगर के एक छोटे आयताकार स्लैब भ्रूण ले जाने के लिए, पर्याप्त चौड़ाई के लिए एक पंक्ति में 10-15 भ्रूण की परत की अनुमति. पृष्ठीय पक्ष नीचे अगर स्लैब और पीछे आप की ओर का सामना करना पड़ रहा समाप्त होता है के खिलाफ: इस स्लैब पर dechorionated भ्रूण संरेखित करें. हम आम तौर पर 5-10 भ्रूण की पंक्तियों बनाते हैं.
- जीना विच्छेदन के लिए एक स्लाइड और हस्तांतरण भ्रूण तैयार
- डबल पक्षीय चिपचिपा टेप के एक छोटे आयताकार टुकड़ा काट और यह सुपर स्लाइड / फ्रॉस्ट प्लस (फिशर साइंटिफिक, 12-550-15 # कैट) के एक छोर के पास जगह है.
- टेप के चारों ओर एक आयत (30-40 लंबे मिमी, और स्लाइड की पूर्ण चौड़ाई) एक मोम कलम के साथ ड्रा, तो है कि वहाँ ~ मोम और टेप (सुपर हिंदुस्तान टाइम्स पैप पेन, के बीच अंतरिक्ष के 3 मिमी है www.rpicorp. com ) और अंगूर की थाली स्लैब से टेप करने के लिए पर भ्रूण, inverting स्लाइड द्वारा और हस्तांतरण धीरे यह भ्रूण पर कम, ताकि टेप पंक्तिवाला अप भ्रूण (विदारक गुंजाइश तहत किया) के साथ संपर्क में आता है है. भ्रूण गठबंधन हो सकता है ताकि पीछे अंत में आप की ओर है चाहिए. अब वे स्लाइड पर पृष्ठीय तरफ ऊपर हो जाएगा.
- तत्काल भ्रूण अधिक 1X पीबीएस (Gibco नुस्खा) जोड़ने के लिए मोम आयत को भरने.
- भ्रूण रहते विच्छेदन
- एक गिलास विच्छेदन सुई (एक इंजेक्शन की सुई से बना) का उपयोग करना, पृष्ठीय midline के साथ काटा, भ्रूण के पीछे के अंत से शुरू.
- भ्रूण के पूर्वकाल अंत प्रहार करने के लिए, ऊपर उठा और स्लाइड के लिए भ्रूण स्थानांतरण जब तक यह चिपक जाती है. बफर में भ्रूण रखें. स्लाइड पर भ्रूण की एक अर्दली लाइन है कि अगर स्लैब पर प्रत्येक पंक्ति से मेल खाता है. पंक्तियों को व्यवस्थित इतना है कि वे सभी स्लाइड पर फिट होगा.
- वहाँ संभव विच्छेदन दृश्यों की एक किस्म है कि fillets पैदा करने में इस्तेमाल किया जा सकता है. लोग आम तौर पर स्वयं dissections कर के माध्यम से अपने खुद के अनुकूलित प्रक्रियाओं के विकास. वीडियो एक अनुक्रम में एक छोटे से कट भ्रूण के पीछे के अंत पर किया जाता है एक दूसरे से शरीर की दीवार के दोनों पक्षों को अलग दर्शाता है. अगर वांछित, एक भी इस कटौती के साथ कनेक्शन / midgut hindgut तोड़ कर सकते हैं और hindgut विस्थापित बाहर स्लाइड पर इस समय (वीडियो में, hindgut विस्थापन बाद में किया जाता है). फिर, कटौती प्रत्येक बस मस्तिष्क lobes के पीछे पक्ष पर बना रहे हैं क्रम में करने के लिए मस्तिष्क से शरीर की दीवारों अलग. भ्रूण की उम्र पर निर्भर करता है, एक भी पृष्ठीय midline नीचे एक उथले कटौती करने के लिए शरीर की दीवारों के बीच amnioserosal संबंध तोड़ की आवश्यकता हो सकती है.
- फिर, धीरे नीचे स्लाइड पर शरीर दीवार के फ्लैप पेस्ट, उन्हें खींच या उनकी सतह से सामग्री को हटाने से परहेज. यह सबसे अच्छा ही सुई शरीर दीवार के पृष्ठीय किनारों पर पूर्वकाल और कूल्हों कोनों से संपर्क करने के लिए अनुमति के द्वारा किया जाता है. मोटर axons यह तक dorsally विस्तार नहीं करते हैं, तो सबसे अच्छा मामले में यह पूरी तरह से बरकरार ISN शाखाओं के साथ एक भ्रूण का उत्पादन होगा. ISN है, कुछ मामलों में बेहतरीन तकनीक के साथ भी हो सकता है, छोटा होगा, क्योंकि भ्रूण हमेशा पृष्ठीय midline साथ बिल्कुल अलग नहीं करता है. यदि सही ढंग से किया, इस विधि क्षेत्रों में शरीर दीवार संरचनाओं T3-A6 (लगभग) की रक्षा करेंगे.
- एक midgut भ्रूण के शीर्ष पर छोड़ कर सकते हैं, और तब सभी dissections को खत्म करने के बाद सभी dissected भ्रूण से इसे हटाने. यह पेट poking, यह भ्रूण से दूर displacing, और यह खींच foregut, जो मस्तिष्क की lobes के तहत निहित करने के लिए अपने संबंध तोड़ने के द्वारा किया जाता है. या, एक प्रत्येक विच्छेदन से पेट हटायें के रूप में यह एक पूर्ण कर सकते हैं. म्यूटेंट है कि असामान्य पेट विकास के साथ, यह dissections को खत्म करने के बाद एक ही बार में सभी हिम्मत हटाने के कारण पेट से जारी जर्दी इसे और अधिक कठिन बाद में हस्तांतरित भ्रूण doublestick टेप से स्थानांतरण के बाद स्लाइड के लिए छड़ी करने के लिए कर सकते हैं एक लाभ यह है . यह कभी कभी उपयोगी भ्रूण स्लाइड के नीचे शुरू (आप की ओर) के बजाय शीर्ष पर, के रूप में की जर्दी सुई की विशिष्ट आंदोलनों की वजह से आप की ओर फैल जाता है हस्तांतरण है.
- फिक्सेशन और / immunofluorescence immunohistochemistry
- इस बिंदु पर, एक या तो भ्रूण तुरंत ठीक कर सकते हैं, अगर एक एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना है, या एक पीबीएस हटाने और संलयन प्रोटीन की सतह पर तैरनेवाला के साथ प्रतिस्थापित कर सकते हैं, अगर एक एक जीवित धुंधला ligand अभिव्यक्ति का पता लगाने का प्रयोग कर रहा है. प्रयोग के इस पहलू के तरीके और रेफरी के पूरक तरीके वर्गों में विस्तार में वर्णित है. [5]
- यहाँ हम निर्धारण प्रोटोकॉल, जो या तो तुरंत या संलयन प्रोटीन धुंधला के बाद किया जाता है का वर्णन. दो पाश्चर pipettes का प्रयोग, पीबीएस में 5% paraformaldehyde के साथ पीबीएस की जगह (ईएमएस, बिल्ली # 15,713 एस, www.emsdiasum.com ). तय समाधान में एक्सचेंज में तीन बार, जो ~ तय समाधान के 6 मिलीलीटर का उपयोग कर, के बाद से एक पाश्चर विंदुक धारण शामिलसमाधान के 1.5-2 मिली. 45 'के लिए तय करो.
- समाधान ठीक करने के लिए निकालें, पीबीएस (3 परिवर्तन) के साथ की जगह है, तो पीबीटी साथ (पीबीएस + ट्राइटन 0.1% X-100 + 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर भिन्न वी BSA, 3 परिवर्तन), तो ~ 200 μl ब्लॉक (समाधान के साथ पीबीटी की जगह 5 + पीबीटी % गर्मी इलाज सामान्य बकरी सीरम), तो ब्लॉक समाधान में वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ. यह बहुत महत्वपूर्ण है meniscus भ्रूण संपर्क करने के लिए, विशेष रूप से करने की अनुमति नहीं है जबकि वे पीबीएस में कर रहे हैं, के रूप में इस dissections को नष्ट कर देगा. डिटर्जेंट के बाद जोड़ा है भ्रूण कम meniscus के प्रति संवेदनशील हो जाते हैं. इस प्रकार, एक ब्लॉक के साथ स्लाइड ढोने वाला और मोम से घिरा क्षेत्र के कोने संक्षेप में एक Kimwipe को छू द्वारा समाधान का सबसे सोख्ता द्वारा पीबीटी जगह ले सकता है. विरोधी शरीर के समाधान के साथ ब्लॉक की जगह एक ही विधि का इस्तेमाल किया जा सकता है. समाधान के इस minimizes carryover.
- 4 में रातोंरात सेते ° सी, तो पीबीटी (> 15 मिनट धो /) के साथ एक कमाल मंच पर एक ट्रे में 3X (यकीन है कि वहाँ काफी है पीबीटी इतना है कि स्लाइड हमेशा पूरी तरह से कमाल के दौरान डूब कर) धोने, reblock रूप में ऊपर वर्णित है, 200 μl माध्यमिक एंटीबॉडी, सेते 2 घंटा जोड़ें. पर आरटी, पीबीटी साथ rewash. अगर गुंजाइश विदारक GFP के तहत वांछित धुंधला (अगर हरी प्रतिदीप्ति प्रयोग किया जाता है) की जाँच करें.
- पीबीएस (5) के साथ 2X धो, तो 4 बजे 500 μl 70% glycerol/1X (एक 50 मिलीलीटर की ट्यूब में 35 मिलीलीटर ग्लिसरॉल, 5 मिलीलीटर 10X पीबीएस, और 10 मिलीलीटर पानी के मिश्रण से बना) Pbs, और स्पष्ट रात भर जोड़ डिग्री सेल्सियस (या आरटी पर 2 घंटा के लिए). ग्लिसरॉल निकालें और एक # 1 coverslip पर डाल दिया.
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Discussion
हमें उम्मीद है कि इस वीडियो प्रदर्शन रहते भ्रूण विच्छेदन और पर्याप्त विस्तार में धुंधला हो जाना है कि वे अब आसानी से कर सकते हैं किसी भी व्यक्ति जो ड्रोसोफिला आनुवंशिकी और भ्रूणविज्ञान में कुछ अनुभव है द्वारा निष्पादित किया जा के लिए हमारे तरीकों को प्रदर्शित किया गया है. बेशक, काफी अभ्यास अभी भी खुद dissections के लिए मुख्य रूप से की आवश्यकता होगी हो सकता है,. हमारे अनुभव में, हर व्यक्ति जो रहते विच्छेदन तरीके सीखता है एक आसानी से अलग विच्छेदन प्रोटोकॉल है कि उसे / उसे सबसे तेजी से उच्च गुणवत्ता वाले arrayed dissections उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है पैदा करेगा. इस प्रक्रिया के पूर्ण विकास के लिए महीने की आवश्यकता है. हालांकि, ज्यादातर लोगों को अभ्यास के कुछ हफ्तों के बाद उच्च गुणवत्ता dissections उत्पन्न कर सकते हैं.
हालांकि हम स्क्रीनिंग के लिए जीना dissections का उपयोग एहसान, वे तय dissections जगह नहीं है, क्योंकि तय विच्छेदन प्रोटोकॉल भ्रूण चरणों की एक व्यापक श्रेणी के लिए लागू किया जा सकता कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, मोटर अक्षतंतु मार्गदर्शन phenotypes के लिए हमारे df किट के विश्लेषण में हमने पाया कि मोटर filopodia अक्षतंतु शाखाओं सहित, के विवरण बेहतर कल्पना रहते fillets के immunofluorescent धुंधला द्वारा पारंपरिक हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) immunohistochemical दृश्य से तुलना किया जा सकता है तय fillets (उच्च गुणवत्ता एचआरपी धुंधला के उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला वेब पेज पर मोटर अक्षतंतु मार्गदर्शन के प्राइमर देखें). हालांकि, 17 चरण की शुरुआत की तुलना में पुराने भ्रूण SuperFrost को छड़ी नहीं है प्लस छल्ली के अपने विकास के लिए कारण स्लाइड जाएगा. इस प्रकार, SNA जैसे देर से विकासशील मोटर अक्षतंतु शाखाओं के लिए phenotypes के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, हम अभी भी तय dissections (ऐडवर्ड्स एट अल. तैयारी में) पर भरोसा करते हैं.
वर्तमान में, इन तरीकों केवल हमारे समूह द्वारा किया गया है कुछ समस्याओं के लिए लागू है. ये पहचान और नए सीएनएस और मोटर अक्षतंतु मार्गदर्शन, अनाथ रिसेप्टर ligands की पहचान में शामिल जीनों के प्ररूपी विश्लेषण और विशिष्ट Mabs द्वारा मान्यता प्राप्त epitopes के संश्लेषण के लिए आवश्यक जीन की पहचान शामिल हैं. हालांकि, कई अन्य अनुप्रयोगों, अनुरूप किया जा सकता है, खासकर जब इन तरीकों हमारे df किट और अस्थानिक अभिव्यक्ति संग्रह के विश्लेषण के साथ संयुक्त कर रहे हैं, या अन्य जांचकर्ताओं द्वारा उत्पन्न संग्रह की. उदाहरण के लिए, यह संश्लेषण, सेलुलर अभिव्यक्ति पैटर्न, या किसी भी प्रोटीन है कि एक उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी या एक GFP रिपोर्टर के द्वारा पाया जा सकता की subcellular स्थानीयकरण के लिए आवश्यक जीनों के लिए व्यवस्थित स्क्रीन करने के लिए संभव होना चाहिए.
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Acknowledgments
हम इन प्रोटोकॉल के विकास के लिए उनके योगदान के लिए Nicki फॉक्स और Aloisia स्च्मिद धन्यवाद. KZ, NS28182 के लिए यह काम एक NIH RO1 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument Co. | BF120-60-10 | |
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige International | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
