VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri

Summary

Biz belirli genotipler Drosophila embriyolar "fileto" hazırlıkları üretmek için akıcı bir protokol açıklar. Bu protokol, genetik ekranlardan çeşitli verimli bir şekilde yürütülmesini sağlar. Aynı zamanda geç embriyo yapıları mükemmel görselleştirme sağlar.

Abstract

Embriyonik gelişim aşamaları 14 ve 17 arasında Drosophila embriyolar "fileto" hazırlıkları kolayca oluşturmak için disseke edilebilir. Bu hazırlıkların, merkezi sinir sisteminin ortasında aşağı doğru akıyor ve beden duvarları ile çevrili. Birçok farklı fenotipleri Bu hazırlıkların kullanılarak incelenmiştir. Çoğu durumda, fileto antikor lekeli sabit tüm monte embriyoların diseksiyon tarafından üretildi. Bu "sabit diseksiyonları" Ancak, bazı dezavantajları var. Onlar çalıştırmak için zaman alıcı ve mutant (GFP-negatif) mutasyonlar GFP dengeleyici kromozom üzerinde tutulur stokları embriyolar sıralamak için zordur. 2002 yılından bu yana, bizim grup yetim reseptörlerine ligandlar tanımlamak için eksikliği ve ektopik ifade ekranlar yürütülmesi olmuştur. Bunu yapmak için, canlı embriyo diseksiyon ve dengeli hatları yüzlerce içeren koleksiyonlar antikor boyama aerodinamik protokolleri geliştirmiştir. Biz sabit diseksiyon ile daha canlı diseksiyon stoklarının büyük koleksiyonlarda fenotipleri incelemek için çok daha verimli olduğu sonucuna varmışlardır. Burada açıklanan protokol kullanarak, tek bir bileşik mikroskop altında inceleyerek her satırın 4-7 mutant embriyolar fenotipleri için gün başına 10 satır, eğitimli birey ekranı. Bu satır başına kadar 70 hemisegments 40X su daldırma lens ile yüksek büyütmede gol beri mutasyonlar, ince, düşük penetrans fenotipleri görüşmekte belirlenmesini sağlar.

Protocol

Giriş

Embriyonik gelişim aşamaları 14 ve 17 arasında Drosophila embriyolar "fileto" hazırlıkları kolayca oluşturmak için disseke edilebilir. Bu hazırlıkların ortasında, merkezi sinir sistemi (MSS) aşağı doğru akıyor ve beden duvarları ile çevrili. Gut kaldırılır. Hazırlık ve müdahale doku olduğundan antikorlar ile boyanarak, fileto, tüm monte embriyolar daha çok merkezi sinir sistemi ve vücut duvarı yapıları (örn. motor aksonlar, kaslar, periferik duyusal nöronları (PNS), trakea) daha iyi görselleştirme izin lamel, fileto ve vücut duvarı boyunca uzanan yapılar tek bir odak düzlemli görüntülenebilmekte sağlayan, düz çünkü. Birçok farklı fenotipleri Bu hazırlıkların kullanılarak incelenmiştir. Çoğu durumda, fileto sabit, antikor lekeli tüm monte edilen embriyoların diseksiyon tarafından üretilir. Bu sabit hazırlıkları aşağıdaki adımları tarafından üretilir: gliserol temizleme çalışmaları 5); 3) metanol ile vitellin membran; immünohistokimya veya immünofloresan kullanarak 4) antikor boyama; 2) paraformaldehid / heptan ile fiksasyon 1) çamaşır suyu ile koryon kaldırılması 6) tungsten iğne ile diseksiyon. Bu "sabit diseksiyonları" boyama Ayrıntılı protokolleri ref verilmiştir. [1].

Sabit diseksiyonları Ancak, bazı dezavantajları var. İlk olarak, anti-GFP algılama için kullanılsa bile, sabit, lekeli mutant (GFP-negatif), hisse senedi veya mutasyonlar GFP dengeleyici üzerinde dengeli olduğu haçlar embriyolar, sıralamak için çoğu zaman zordur. Bu GFP anne ifadesi de dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin nedeniyle. Örneğin, sabit, lekeli homozigot mutant embriyolar veya aktin-GFP armadillo (kol) ya-GFP dengeleyici kullanarak dengeli üçüncü kromozom stoklarından sıralamak için neredeyse imkansız olduğunu bulduk. İkincisi, yüksek kalitede sabit diseksiyonları oluşturmak için oldukça zaman alıcıdır. Insanların çoğu bu saatte yaklaşık 10-15 kadar hızlı. Üçüncü bir antikor lekeleri bu hem iç hem de dış yapı, dış yapı "batırılmış" ve iç yapılarına nüfuz etmez, çünkü antikor epitoplar düzeltmek için hassas, ya da, bazı antikorlar (ya sabit diseksiyonları de leke yok örneğin fasciclin III (Fas3)) karşı antikorlar. Ligand ifade algılamak için reseptör füzyon proteinleri ile Dördüncü, canlı boyama sabit hazırlıklar yapılabilir.

2002 yılından bu yana, grubumuzun RPTP ligandlar tanımlamak için eksikliği (Df) ve ektopik ifade ekranları yapmak olmuştur. Bunu yapmak için, dengeli hatları yüzlerce içeren koleksiyonlar canlı embriyo diseksiyon ve boyama için aerodinamik protokolleri geliştirmiştir. Boyama reseptör füzyon proteinleri ile yetim reseptör ligandlar için birçok grup tarafından istihdam edilen özel bir uygulamadır. Ancak, birçok grup embriyonik fenotipleri görselleştirmek için fileto antikor boyama kullanırım. Bu yöntemlerin geliştirilmesi yoluyla, sabit diseksiyon ile daha canlı diseksiyon stoklarının büyük koleksiyonlarda fenotipleri incelemek için çok daha verimli olduğu sonucuna varmışlardır. Biz canlı diseksiyonu fazla 600 DFS motor akson, merkezi sinir sistemi ve kas fenotipleri karakterize etmek için kullanılan ve aynı zamanda 400 den fazla farklı hücre yüzey ektopik ifade ve salgılanan proteinler (AW ark hazırlık tarafından üretilen sinir sistemi fenotipleri karakterize var. HK L. ve ark, hazırlanmakta).

Biz kullandık canlı diseksiyonu protokolleri yıllar boyunca evrildi. Yazarlardan biri (KZ) ilk Nipam Patel, sonra yüksek lisans öğrencisi Corey Goodman laboratuarda diseksiyon yaşamak için daha 20 yıl önce başlandı. Daha yakın zamanlarda, diğer tüm deneyler için anti-Fas3 [2], ancak istihdam sabit diseksiyonları CNS leke için bu yöntem kullanılır. 1999 yılında, Aloisia Schmid, sonra bir doktora sonrası araştırma grubumuz, bize o çift zincirli RNA enjekte edilen embriyolar [3, 4] fenotipleri incelemek için kullanılan cam iğneler, canlı diseksiyon tanıttı. Birkaç yıl sonra RPTP ligand ekranları yapıyor başladığında, GFP dengeleyici üzerinde tutulan hisse senetlerinin büyük koleksiyonları hızlı analiz izin onu protokolleri değiştirilmiş. GFP-negatif embriyolar, embriyoların GFP ifade yaşayan ve ince farkları kolayca tespit edilebilir sıralanır çünkü önemli anne GFP ifade (TM3armGFP dengeleyici örneğin) olduğunda bile GFP dengeli stokları kolayca sıralanabilir olduğunu bulundu . [5] bir Lar ligand için başarılı Df ekran açıklanmıştır.

Mevcut protokolleri kullanarak, tek bir Eğitimli bir bireyin, bir bileşik mikroskop altında inceleyerek her satırın 4-7 mutant embriyolar fenotipleri için günde 5-10 hatları, perde. Embriyoların seçilmesi ve arraying sonra, 50 embriyolar incelemek için yaklaşık bir saat sürer. Bu yöntem, ince, düşük penetrasyon görüşmekte mutasyonları tespit sağlar.nce fenotipleri, satır başına kadar 70 hemisegments beri 40X su daldırma lens ile yüksek büyütmede puanlanır. Böyle fenotipleri diseksiyon mikroskobu altında lekeli bütün montaj embriyoların ekranlarında algılamak için zor veya imkansız olacaktır.

Biz yaklaşık 250 satırları içerir ve genomu yaklaşık yarısı (AW ve ark. Hazırlanmasında) temsil eden fenotipik tarama için Df kiti tanımlamıştır . 2002-2003 RPTP ligand sentezi [5] için gerekli olan genler için var olduğu gibi bu kit geliştirme Bloomington Df takımı ekranın bir parçası olarak başladı. Bu ekranın derste, biz daha iyi gelişmesi için tercihen moleküler eşlenen küçük DFS bir merkezi sinir sistemi (ve bu nedenle merkezi sinir sistemi için ligand ifade gösterildi olamazdı), Df / Df homozigot geliştirmek vermedi Bloomington kiti DFS yerine.

Fenotipik tarama kiti çizgiler df / Df homozigot, merkezi sinir sistemi, PNS, kas lifleri, trakeal ağ ve birçok diğer dokularda gelişimini etkileyen genler için sistematik olarak ekrana bir araştırmacı izin aşamasında 16, normal genel morfolojileri var. Herhangi bir yapı, ifade desen, ya da spesifik bir antikor ya da GFP işaretleyici ile evre 14-16 visualizable hücre içi lokalizasyonu deseni bu kit kullanarak fenotipleri için taranmalıdır. Bu protokol ile, burada açıklanan gelir, onun yarım / Bu proje onu zaman bir kişi harcamaları sistematik bir yıl altı ay içinde istediğiniz herhangi bir embriyonik fenotip için tüm Drosophila genlerin yarısı ekrana olabilir.

A. Drosophila embriyo toplama

1. "Beş-Namlu" yumurta toplama odaları hazırlayın

Bu odaların, çok sayıda sinek hatları incelerken zaman ve emek tasarrufu.

1. Silikon kauçuk MASTÝK kullanarak birlikte 100 x 15 mm plastik Petri kabı ve yapıştırıcı tüpleri bir alt kısmı baş aşağı beş 50ml Konik Tüpler düzenleyin.
2. Tutkal tutkal Petri kabı alt kısmında tüplerin konik uçları üzerine sertleştirilir. Beş konik tüpler Petri kabı içinde duracak.
3. Sıcak bir iğne kullanarak, tüpler hava dolaşımı için delik açmak.

2. Yumurta toplama plakaları hazırlayın

1. Her 100 x 15 mm plastik Petri kabı üzüm agar jel (% 1) 7ml dökün. Jel ideal kalınlığı 3-4 mm her konik tüp mühür ve 24 saat boyunca nem sağlar. Jel, çok kalın ise, plaka değişikliği aşağı düşebilir.
2. Jel plakları serinlemek sonra, kapak ve bu orijinal plastik Petri kabı torbaya koydu. 4 sıkıca torbasının ve mağaza ° C

3. Sinekler hazırlayın

1. Doğru aşamada embriyo kolay seçim için yeterli yumurta elde etmek için, biz> 20 erkek ile birlikte, bir haç> 50 bakireler koymak için çalışıyoruz.
2. Çapraz ekranlı olması ise, ortasında dikilmiş çok sayıda alt kuru maya pelet (ortadan ikiye katlanıp, 10 X 100 mm), ince bir kağıt şeridi ile bir sinek gıda flakonda dişi ve erkek sineklerin karıştırmak ve tutmak gıda. Kağıt şerit daha fazla yüzey alanı sağlamak ve aşırı nemden sineklerin devam edecektir.
3. En az 3 gün boyunca oda sıcaklığında sinekler şişeleri tutun.
4. Bir şişe bir stok ekranlı olması ise, sadece toplama odasına sinek aktarmak.

4. Transfer Beş varil yumurta toplama odaları uçar.

1. Yumurta toplama odalarının her varil etiketleyin.
2. Her bir varil için bir yumurta toplama plakası maya yapıştırın koyun.
3. 20 inç uzunluğunda etiketleme bant odası ve plaka birlikte tutmak için hazırlayın. Kolay plaka değiştirmek için her iki uçtan 10 mm katlayın.
4. Sinek şişeleri CO ₂ gaz enjekte edilir ve sinekler etiketli varillerin içine aktarmak.
5. Yumurta toplama plaka ile bölmesi kapağı ve aşağı doğru bastırın.
6. Odası ve agar plaka ortasından başlayarak birlikte plaka etrafında Teyp. Bant yumurta toplama plakası üst üste.

5. Embriyolar toplayın

1. Yumurta toplama plakası hazırlayın: her bir varil için bir yumurta toplama plakası maya yapıştırın koyun.
2. Yumurta toplama odalarında sinekler dokunun ve odaları etrafında bandı çıkarın (eski plaka sıkıca tutun).
3. Sinekler tekrar aşağı dokunun ve eski yeni bir plaka değiştirin.
4. 2-4 saat için eğimli pozisyonda embriyolar toplayın.
5. Yumurta toplama plakası istenilen zamanda değiştirin.

6. Yaş embriyolar

Islak 90 mm daire filtre kağıdı ile kaplı bir Petri plaka üzerinde baş aşağı yumurta toplama plakası yerleştirin ve istenilen sıcaklıkta tutmak. Aşamasında dengeli bir mutant hatları 16 embriyolar diseksiyonları için, biz genellikle geç sabah bir koleksiyon yapmak, daha sonra embriyolar inkübe19 r> 22 saat ° C. UAS/GAL4 sistemi kullanarak kazanç fonksiyon-çalışmalar için, biz 19, öğleden sonra ve 16 saat süreyle inkübe RT embriyolar toplamak ° C Ertesi gün 1 ya da 2 saat süreyle UAS/GAL4 sistemini aktive etmek için 29 ° C inkübatör embriyolar transfer. Bu kadar süre sonra, diseksiyon yapılır aşamada 16 olacağını, bu yüzden embriyolar çoğunlukla aşamada 15, ve bu embriyolar GFP ifade sıralamak ve onları hizaya için yeterli zaman sağlar.

7. Embriyolar evreleme ve GFP ifade için sıralama.

Embriyoların genotipleri ayrımcılık için, GFP dengeleyici. Biz kapsamı diseksiyon Olympus GFP altında çift kaset sopa dechorionated embriyolar (bir sonraki bölüme bakın) incelemek ve aynı zamanda yaş ve GFP ifade için onları seçin.

a) GFP sıralama:

1. Kullandığımız 2. kromozom dengeleyici (CyOarmGFP) ektoderm boyunca ifade armadillo organizatörü tarafından tahrik GFP vardır. CyOarmGFP heterozigot, zeytin yeşili ve CyOarmGFP homozigot parlak yeşil. Neredeyse hiç GFP ifade (embriyolar hiçbir GFP dengeleyici bir hisse senedi gibi görünüyorsun) çünkü bir CyoarmGFP stok, dengeleyici eksikliği embriyolar kolayca ayırt edilirler.
2. Daha maternal tahrik GFP ifade çünkü 3. kromozom dengeleyici (TM3armGFP) sıralamak için kullanmak zordur. Sonuç olarak, embriyoların daha az yeşil kategoriye ayrılır. Bazı uygulama ile, her biri diğerinden daha az ve daha yeşil embriyolar sıralamak için genellikle basit, ama kümeleme ve transferinden sonra (TM3armGFP heterozigot) diğerlerinden daha fazla yeşil ara sıra embriyolar toplama başvurmak için de gerekli agar plağına. Aksi takdirde, yanlış genotip bazı embriyolar emin vardır.
3. X dengeleyici FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Bu doku özel bir desen ifade edilir. Aşamalarında 15-16 sıralama ile ilgili desenler amnioserosa ve baş ifade Bolwig organ hücreleri iki nokta vardır. Ne yazık ki, bir embriyolar sıralamak istiyor aşamada, amnioserosa solmaya ve Bolwig organlarının parlamaya henüz başlamamış. GFP için onları sık sık puan, onları haddeleme, kasete embriyolar çok dikkatli bakmak, böylece gerekli olan ve agar plaka üzerinde başvurmak şarttır. Genellikle iki kez bunu bir kez plaka hareketli bant tüm embriyoların hemen sonra, tekrar uygun bir safhasında yaşlanma sonra, diseksiyon için hazırlık sıraya onları hemen önce. Bazen, GFP, görselleştirme, bu koşullar altında daha iyi, çünkü biz de, PBS havuzu (aşağıya bakın) embriyo transferinden sonra, GFP kapsamında slayt yeniden inceler. Sonra, biz sadece diseksiyonu başlamadan önce, GFP embriyoları yok.

b) Evreleme

St etrafında embriyolar evreleme için birincil araçtır. 14-16 bağırsak morfolojisi. Gut, GFP kapsamında otofloresans ile parlıyor. Dönem embriyoların çalışmadan önce, bir onlar gibi görünmelidir ne anlar ki, referans kitap veya (Hartenstein ve Campos-Ortega yeşil kitap gibi), resim ve diyagramları embriyo sitelere başvurmalısınız . Diseksiyon için ideal aşamasında bağırsak üç bantları bölünür. Bundan önce, bağırsak tek bir blob olarak görünür. Sık sık türlü blob aşamada embriyo ve daha sonra diseksiyon için en iyi sahne ulaşana kadar yaşları. Üç-bant aşamadan sonra, gut, çapraz kuyruk civarındaki bant, ve sonra bobinleri geliştirmeye başlar ve embriyo iyi anlaşılacaktır. Bu süre içinde, cam slayt üzerine sopa çünkü embriyo incelemek için zor olur. Bir geç dönem 16/early aşamada 17 embriyolar incelemek isterse, birçok embriyolar, incelemek ve gut morfolojileri, sopa veya sopa embriyolar ile ilişkili olan değerlendirmek için gereklidir. Bu biraz sıra genotipler arasında değişir.

B. Drosophila embriyo canlı diseksiyonu

1. Embriyo dechorionation
   1. Bir slayt üzerine çift taraflı yapışkan bant ve üzüm plaka levha hazırlayın
   2. Islak bir fırça kullanarak çift taraflı yapışkan bant toplama plakasından yaşlı embriyolar transfer. Eşit embriyolar yayıldı.
   3. Körelmiş bir diseksiyon iğne ile hafifçe üzerinden onları haddeleme çift taraflı yapışkan bant embriyolar Dechorionate. Dechorionation sonra, embriyolar diğer embriyolar veya koryon daha iğne sonuna kadar daha güçlü bir sopa, ama güçlü bir bant olarak; böylece koryon üstüne veya diğer embriyoları üzerine bir rulo, daha sonra embriyolar asansörleri kapalı ve üzüm plaka levha aktarır. Genotiplendirme ve evreleme (Detaylı açıklama için yukarıya bakınız) dechorionation süreci sırasında yapılan veiğne transfer.
   4. Genotipi ve yaş için başvurmadan sonra bir satır 10-15 embriyo sıraya izin vermek için yeterli genişliği, agar daha küçük bir dikdörtgen levha embriyoları taşımak. Aşağı doğru bakacak agar döşeme ve arka uçları karşı bu levha üzerinde dorsal yüzü: dechorionated embriyolar hizalayın. Biz normalde 5-10 embriyoların satır olun.
2. Canlı diseksiyon için bir slayt ve transfer embriyolar hazırlayın
   1. Çift taraflı yapışkan bant küçük, dikdörtgen bir parça kesin ve bir ucunu Super Frost / Plus slayt (Fisher Scientific, Kedi # 12-550-15) yakınında yer.
   2. Balmumu kalem ile kaset etrafına bir dikdörtgen çizin (uzun 30-40 mm ve slayt tam genişliğinde), balmumu ve bant (Super HT Pap Kalem, ~ 3 mm arasında boşluk olacak şekilde www.rpicorp. com ) ve slayt tersine, bandın üzerinde üzüm plaka levha embriyoların transferi ve bant hafifçe çizgili embriyolar (diseksiyon kapsamında yapılan) ile temas, böylece embriyoları üzerine düşürücü. Embriyolar arka sonuna doğru şekilde aynı hizada olmalıdır. Onlar şimdi slayt dorsal yüzü yukarı olacak.
   3. Hemen 1X PBS (Gibco tarifi) balmumu dikdörtgen doldurmak için embriyolar üzerinde eklemek.
3. Embriyo canlı diseksiyonu
   1. Dorsal orta hat boyunca bir bardak diseksiyonu iğne (enjeksiyon iğnesi yapılmış) kullanarak, embriyonun arka ucundan başlayarak kesilmiş.
   2. Poke embriyo ön ucu, yukarı kaldırın ve sopalarla kadar slayt embriyo transferi. Tamponunda embriyolar tutun. Agar levha üzerindeki her bir satır eşleşen slaytta embriyo düzenli bir çizgi olun. Hepsi slayt uyacak şekilde satırları düzenleyin.
   3. Filetosu oluşturmada kullanılan çeşitli olası diseksiyonu dizilerinin vardır. İnsanlar genellikle diseksiyonları kendileri yapıyor yoluyla kendi optimize edilmiş prosedürleri geliştirmek. Video vücut duvarının her iki tarafın birbirinden ayrı embriyo arka sonunda küçük bir kesim yapıldığı bir dizi göstermektedir. İsterseniz, bir de bu kesim ile midgut / hindgut bağlantı kırmak, ve şu anda (video, hindgut deplasman sonra yapılır) slayt üzerine hindgut yerinden. Sonra, kesik beyin beden duvarları ayırmak için sadece arka beyin lobları her tarafında yapılır. Embriyonun yaşına bağlı olarak, bir de beden duvarları arasındaki amnioserosal bağlantıyı koparmak için dorsal orta hat aşağı sığ bir kesim yapmak gerekebilir.
   4. Sonra, yavaşça germe veya kendi yüzeyinden malzeme kaldırarak kaçınarak, vücut duvarının kapakları aşağı slayt üzerine yapıştırın. Bu en iyi, sadece vücut duvarının dorsal kenarları iğne ön ve arka köşeleri ulaşmasını sağlayan tarafından yapılır. Motor aksonlar en iyi durumda bu tamamen bozulmadan ISN şubesi ile bir embriyo üretecek kadar dorsal genişletmek yok. Embriyonun dorsal orta hat boyunca her zaman tam olarak ayrı değildir, çünkü bazı durumlarda ISN, hatta en iyi tekniği ile kesilmiş olacaktır. Bu yöntemin doğru bir şekilde yapılırsa, T3-A6 (yaklaşık) segmentlerinde vücut duvarı yapıları koruyacaktır.
   5. Bir embriyonun üst midgut bırakın ve daha sonra tüm diseksiyonları bitirdikten sonra disseke embriyolar çıkarın. Bu, gut alay embriyo uzak yerinden ve beyin lobları altında yatıyor foregut olan bağlantıyı kesmek için germe yapılır. Veya bir tamamlar, biri her diseksiyonu gut kaldırabilirsiniz. Anormal gut gelişme var mutantlar, gut salınan yumurta sarısı, daha zor doublestick bant transferinden sonra slayt embriyolar daha sonra transfer sopa yapabilirsiniz, çünkü diseksiyonları bitirdikten sonra bir kerede tüm cesareti kaldırmak için bir avantaj . Bu embriyolar, yumurta sarısı iğne tipik hareketleri nedeniyle size doğru yayılma eğilimi olarak, üst kısmında (doğru) slayt altındaki başlangıç ​​yerine transfer etmek için bazen yararlı olabilir.
4. Fiksasyon ve immünofloresan / immünohistokimya
   1. Bu noktada bir antikorlar ile boyanarak ise, birini hemen embriyoların düzeltmek, ya da bir ligand ifade algılamak için bir canlı boyama deney yapıyor, bir PBS kaldırmak ve füzyon proteini süpernatant ile değiştirin. Deneyin bu yönü ref Yöntem ve Tamamlayıcı Yöntemler bölümlerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. [5].
   2. Burada hemen ya da füzyon proteini boyama sonra yapılır fiksasyon protokolü açıklar. Iki Pasteur pipetler kullanarak, PBS PBS içinde% 5 paraformaldehid ile replace (EMS, Kedi # 15.713-S, www.emsdiasum.com). Fix çözüm Exchange üç kez Pasteur pipeti tutan bu yana, yaklaşık 6 ml düzeltme çözüm kullanmayı gerektirir1.5-2 ml çözüm. 45 'saptamak için.
   3. Çözüm düzeltmek çıkarın, PBT sonra, PBS (3 değişiklik) ile değiştirin (PBS +% 0.1 Triton X-100 + 1 mg / ml Kesir V BSA; 3 değişiklik), daha sonra ~ 200 ul blok solüsyonu (PBT yerine PBT + 5 % ısıl işleme tabi normal keçi serumu), daha sonra blok çözüm istenen birincil antikor ile. PBS içinde ise bu diseksiyonları yok gibi, menisküs, özellikle embriyoların temasa izin vermeyecek şekilde çok önemlidir. Deterjan eklendi sonra embriyoların menisküs daha az duyarlı hale gelir. Böylece, bir slayt devrilme ve balmumu içine alan köşesinde kısa bir süre Kimwipe dokunarak en çözüm blot PBT blok ile değiştirebilirsiniz. Aynı yöntem, anti vücut çözüm blok yerine kullanılabilir. Bu çözüm en aza indirir taşınmasını.
   4. 4 gece inkübe ° C, daha sonra (PBT slayt her zaman tamamen sallanan sırasında batırılır, böylece yeterli emin olun) PBT (> 15 dakika / yıkama) ile sallanan bir platform üzerinde bir tepsi 3X yıkama, reblock gibi, yukarıda açıklanan 200 ul ikincil antikor, inkübasyon 2 saat ekleyin. at RT ile rewash PBT. GFP diseksiyon kapsamı altında istenirse boyama (yeşil floresan kullanılması durumunda) kontrol edin.
   5. 2X PBS (5 ') ile yıkayın, sonra 4 gecede 500 ul% 70 glycerol/1X PBS (50 ml'lik bir tüp içinde 35 ml gliserol, 5 ml 10X PBS, 10 ml su karıştırılarak yapılmış) ve net ° C (ya da oda sıcaklığında 2 saat). Gliserol çıkarın ve # 1 lamel koymak.

Discussion

Biz bu video gösteri artık kolayca Drosophila genetik ve embriyoloji bazı deneyimi olan herhangi bir kişi tarafından idam edilebilir canlı embriyo diseksiyon ve yeterli ayrıntıda boyama yöntemleri görüntülenir olduğunu umuyoruz. Tabii ki, öncelikle diseksiyonları kendileri için önemli bir uygulama hala gerekli olacaktır. Bizim tecrübelerimize göre, her canlı diseksiyon yöntemleri öğrenir kişi onu / onu en hızlı, yüksek kaliteli dizilmiş diseksiyonları üretmek için izin veren bir kurnazca farklı diseksiyon protokolü yaratacaktır. Bu süreç tam gelişmesi için ay gerektirir. Ancak, insanların çoğu uygulama birkaç hafta sonra, yüksek-kaliteli diseksiyonları üretebilirsiniz.

Tarama için canlı diseksiyonları lehine olmasına rağmen, embriyonik gelişim evrelerinin daha geniş bir sabit diseksiyonu protokolleri uygulanabilir, çünkü, onlar, sabit diseksiyonları yerine olamaz. Örneğin, motor akson rehberlik fenotipleri için Df kiti analizi, biz filopodia dahil olmak üzere motor akson dalları, ayrıntıları geleneksel horseradish peroksidaz (HRP) immünohistokimyasal görselleştirme daha canlı fileto immunofluorescent boyama tarafından daha iyi görülebilmesi bulundu sabit filetosu (yüksek kaliteli HRP boyama örnekleri, laboratuvar web sayfamızı motor akson rehberlik astar). Ancak, 17 sahne başında daha büyük embriyolar SuperFrost sopa Ayrıca manikür gelişim nedeniyle slaytlar olmaz. Böylece, SNA gibi geç gelişen motor akson dalları için fenotipleri kantitatif analiz için, biz hala sabit diseksiyonları (AW ve ark. Hazırlanıyor) güveniyor.

Şu anda, bu yöntemler sadece bizim grup tarafından birkaç problem olmuştur. Bunlar, merkezi sinir sistemi ve motor akson rehberlik kimlik, yetim reseptör ligand alan yeni genlerin tanımlanması ve fenotipik analiz ve özel mAbs tarafından tanınan epitoplar sentezi için gerekli olan genlerin belirlenmesi içerir. Ancak, diğer birçok uygulama bu yöntemleri Df kiti ve ektopik ifade toplama analizi ile birlikte, özellikle, öngörülen ya da diğer araştırmacılar tarafından oluşturulan koleksiyonlar olabilir. Örneğin, sentez, hücresel ifade desen, ya da yüksek kaliteli bir antikor ya da GFP muhabiri tarafından tespit edilebilir herhangi bir proteinin hücre içi lokalizasyonu için gerekli olan genler için sistematik bir ekran mümkün olmalıdır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate Tubing With Filament	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Narishige model PC-10 needle puller	Narishige International		Tubes pulled using a heater level of 58.9