Biology

लेजर Microdissection से कोशिकाओं के सबसेट के जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा लागू करने के लिए ड्रोसोफिला विंग डिस्क

Published: April 30, 2010 doi: 10.3791/1895

Rosario Vicidomini¹, Giuseppe Tortoriello¹, Maria Furia¹, Gianluca Polese¹

¹Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale, University of Naples

Summary

लेजर microdissection ड्रोसोफिला विंग डिस्क के विशिष्ट डिब्बों में जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा का विश्लेषण स्थानीयकृत आरएनएआई के अधीन करने के लिए लागू किया गया था

Protocol

भाग 1. ड्रोसोफिला Imaginal विंग विशिष्ट और स्थानीयकृत आरएनएआई के अधीन डिस्क की तैयारी.

जैविक सामग्री के रूप में, हम ड्रोसोफिला imaginal विंग डिस्क ट्रांसजेनिक ^GAL4/UAS एक प्रणाली के माध्यम से स्थानीय और विशिष्ट जीन मुंह बंद करने के लिए अधीन लार्वा से प्राप्त इस्तेमाल किया. GAL4 ड्राइवर, यूएएस प्रत्युत्तर दूसरा ले: यह लार्वा संतान एक आनुवंशिक पार से दो माता पिता लाइनों को शामिल orginates. एक विशिष्ट लौकिक और / या स्थानिक पैटर्न में GAL4 व्यक्त अलावा, चालक लाइन एक संवाददाता यूएएस - GFP कि GAL4 अभिव्यक्ति डोमेन कल्पना की अनुमति देता है वहन करती है. यूएएस प्रत्युत्तर लाइन यूएएस अनुक्रम के नियंत्रण के अधीन व्यक्त, एक बाल के लिये कांटा मुंह बंद (hpRNA) शाही सेना के लिए विशेष रूप से ब्याज की चयनित जीन (यह कॉल जीन एक्स) ² लक्षित करने में सक्षम है. एक बार सेल में व्यक्त किया, hpRNA एक्स छोटे हस्तक्षेप (siRNA) शाही सेना के लिए विशेष रूप से चयनित जीन चुप्पी सक्षम उत्पन्न cleaved है. संतान में लार्वा, जो दोनों के चालक और प्रत्युत्तर transgenes यूएएस - मुंह बंद का निर्माण केवल उन GAL4 प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं में लिखित है किया जाता है, और इस प्रकार चयनित जीन एक्स के एक spatially सीमित मुंह बंद प्रेरित करने में सक्षम है

संभव अनुप्रयोगों के विभिन्न प्रकार के अलावा, हम इस दृष्टिकोण को लागू करने के लिए हमारे हित के एक चयनित जीन (जीन एक्स) engrailed - GAL4 के नियंत्रण के तहत (एन) ^{ड्राइवर,} जो विंग 3 डिस्क के पीछे डिब्बे में विशिष्ट मुंह बंद ट्रिगर कर सकते हैं मौन , जिसका क्षेत्र transgene यूएएस - GFP की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित किया गया था.

खामोश imaginal विंग डिस्क हाथ dissected थे, देखभाल लेने के लिए आसपास के ऊतकों contaminating, विशेष रूप से पालन tracheas को खत्म करने. प्रत्येक पृथक विंग डिस्क तो जल्दी से और धीरे से चयनित क्षेत्रों की तत्काल लेजर microdissection के लिए पहले से इलाज, RNase मुक्त विच्छेदन फ्रेम को हस्तांतरित.

भाग 2. (पोस्टीरियर) खामोश और unsilenced विंग डिस्क (पूर्वकाल) डिब्बों से चयनित क्षेत्रों के लेजर microdissection.

एक बार पंख डिस्क झिल्ली पर था, विशिष्ट क्षेत्रों के लेजर (पोस्टीरियर; GFP-लेबल) खामोश से microdissection और unsilenced (पूर्वकाल; GFP-unlabelled) डिब्बों हासिल की थी. यह एक क्षेत्र है कि आसानी से दोनों में फिट सकता है ड्राइंग द्वारा प्रदर्शन किया गया था, डिस्क की GFP सकारात्मक और GFP नकारात्मक पक्ष. Microdissector के तहत, हम पहले GFP पॉजिटिव ऊतक पर ध्यान केंद्रित लेजर बीम, चयनित परिधि साथ एक कट बनाने. चयनित गति और शक्ति में कटौती के साथ microdissector आय, लेकिन इसे काटने मैन्युअल परिष्कृत करने के लिए संभव है, जब तक ऊतक के चयनित क्षेत्र के नीचे ट्यूब में आता है. इस ट्यूब त्रिकोणीय अभिकर्मक की एक छोटी मात्रा शामिल है, ताकि GFP-सकारात्मक ऊतक बाद में शाही सेना निकासी के लिए तैयार है.

हम बाद में विपरीत कटिंग क्षेत्र चले गए, पंख डिस्क की GFP नकारात्मक पक्ष क्रम में unsilenced, GFP नकारात्मक ऊतक से एक बराबर क्षेत्र काटना. एक बार फिर से, स्वत: कटौती के बाद, हम कटौती मैन्युअल शोधन के लिए रवाना हुए. एक बार कट किया था, भी GFP-नकारात्मक ऊतक त्रिकोणीय अभिकर्मक में बरामद किया गया था, शाही सेना निकासी के लिए तैयार है.

भाग 3. शाही सेना और Microdissected ऊतक क्षेत्रों से ट्रांसक्रिप्शन रूपरेखा निकालना.

हम ट्यूबों काता टोपी से तरल अलग और त्रिकोणीय अभिकर्मक जोड़ी 1 मिलीलीटर, तो मानक त्रिकोणीय अभिकर्मक प्रोटोकॉल के बाद शाही सेना निकासी प्रदर्शन. पर्याप्त सामग्री इकट्ठा करने के लिए, हम 100 imaginal पंख डिस्क पर काटने प्रक्रिया को दोहराया. ² के बारे में 5000 सुक्ष्ममापी प्रत्येक के 100 क्षेत्रों से शुरू, हमारी उपज शाही सेना के 1.5 μg की थी. पुस्तिका विच्छेदन की शुद्धता तो RT-पीसीआर द्वारा खामोश है और unsilenced नमूनों में GFP अभिव्यक्ति की जाँच के द्वारा नियंत्रित किया गया है, सुपर स्क्रिप्ट III (Invitrogen) का उपयोग करने के लिए रैंडम Hexamers साथ सीडीएनए synthesize करने. बाद मात्रात्मक विश्लेषण अपनी विनियामक मार्ग के ख्यात लक्ष्य के उन लोगों के साथ मिलकर, खामोश जीन एक्स की अभिव्यक्ति के स्तर निर्धारित करने के लिए ध्यान केंद्रित, रीयल टाइम RT-पीसीआर मास्टर मिक्स (Invitrogen) का उपयोग कर के द्वारा प्रदर्शन किया गया.

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Discussion

अपने बेसल अभिव्यक्ति स्तर unsilenced पंख डिस्क के पूर्वकाल / पीछे डिब्बों में हासिल करने के लिए सम्मान के साथ, चयनित जीन एक्स की गतिविधि मुंह बंद करने पर 40% तक कम पाया गया. इसके विपरीत, अपने ख्यात लक्ष्य (जीन वाई) के एक काफी पाया गया था विनियमित (7 गुना वृद्धि), हमें परिकल्पना मान्य करने के लिए कि यह नकारात्मक जीन एक्स द्वारा विनियमित किया गया था प्रमुख

हम निष्कर्ष है कि ऊपर वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण सफलतापूर्वक विविध नियामक रास्ते के ख्यात लक्ष्य के सत्यापन के लिए लागू किया जा सकता है.

इसके अलावा, हम शंका है कि शाही सेना निकासी की उपज में सुधार तेजी से स्थानीयकृत प्रतिलेखन प्रोफाइलिंग की माइक्रोएरे विश्लेषण द्वारा लक्षण वर्णन अनुमति दे सकता है. इस संभावना को खोलने के लिए महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं के एक अधिक विस्तृत दृश्य प्राप्त करने के होगा. उदाहरण के लिए, morphogenetic ^{4 gradients, 5} या transcriptional सेल प्रतियोगिता के ⁶ प्रक्रिया को रेखांकित स्विच, जहां खोने और विजेता सेल क्लोनों स्थानीयकृत गठन अंतर GFP अभिव्यक्ति द्वारा visualized हो सकता है, और अधिक विशेष रूप से संबोधित किया जा सकता है सकते हैं. जो भी आवेदन, इस दृष्टिकोण को उनके मूल ऊतक के संदर्भ में विभिन्न सेलुलर प्रदेशों के transcriptional प्रतिक्रिया को परिभाषित करने में मदद कर सकते हैं.

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Acknowledgments

लेखकों मुनाफे धन्यवाद. Chiara Campanella और क्षमता के AMRA केंद्र, विश्वविद्यालय नेपल्स Federico द्वितीय के, नेपल्स, इटली लेजर microdissector के उपयोग के साथ उन्हें प्रदान करने के लिए, और 3 डी एनीमेशन में उदार मदद के लिए श्री Vincenzo Vicidomini.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection ². A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection ². A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).

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References

Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. Dahmann, C. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2008).
Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).
Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).
Martin, F. A., Morata, G. Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc. Development. 133, 4421-4426 (2006).
Tabata, T. Genetics of morphogen gradients. Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).
Moreno, E. &, Basler, K. dMyc transforms cells into super-competitors. Cell. 117, 117-129 (2004).