Microdissezione laser applicata a profili di espressione genica di sottogruppo di cellule dal Drosophila Ala Disco

Summary

Microdissezione laser è stato applicato per analizzare il profilo di espressione genica in specifici comparti di disco Drosophila ala sottoposta a localizzate RNAi

Abstract

Natura eterogenea dei tessuti ha dimostrato di essere un fattore limitante per la quantità di informazioni che possono essere generati da campioni biologici, compromettendo le analisi a valle. Considerando le associazioni complesso e dinamico cellulari esistenti in molti tessuti, per ricapitolare le interazioni in vivo analisi molecolare si deve essere in grado di analizzare popolazioni di cellule specifiche all'interno del loro contesto d'origine. Laser-mediata microdissezione può raggiungere questo obiettivo, consentendo l'identificazione univoca e la raccolta di successo delle cellule di interesse sotto il diretto visualizzazione microscopica, pur mantenendo l'integrità molecolare. Abbiamo applicato questa tecnologia per analizzare l'espressione genica nelle aree definite di sviluppare disco Drosophila ala, che rappresenta un vantaggioso sistema modello per studiare il controllo della crescita, differenziazione cellulare e l'organogenesi. Larvale dischi immaginale precocemente sono suddivise in compartimenti anteriore e posteriore, dorsale e ventrale da confini restrizione lignaggio. Avvalendosi della inducibile GAL4-UAS sistema di espressione binario, ciascuno di questi comparti possono essere etichettate in modo specifico le mosche transgeniche esprimere un transgene UAS-GFP sotto il controllo del competente GAL4-driver costruire. Nei dischi transgenici, il profilo di espressione genica di sottoinsiemi discreti di cellule possono essere, appunto, determinata dopo microdissezione laser-mediata, utilizzando il segnale fluorescente GFP guidare taglio laser.

Tra le varietà di applicazioni a valle, ci siamo concentrati sulla profilazione trascrizione RNA dopo localizzato interferenza dell'RNA (RNAi). Con l'avvento della tecnologia RNAi, GFP etichettatura può essere accoppiato con knockdown localizzata di un dato gene, che consente di determinare la risposta trascrizionale di una popolazione di cellule discreti per il silenziamento genico specifico. Per convalidare questo approccio, abbiamo sezionato aree equivalenti del disco dalla parte posteriore (l'etichetta di espressione GFP), e la parte anteriore (non marcato) su vano tacere regionali nel comparto P di un altro gene ubiquitariamente espresso. L'RNA è stato estratto da microdissezionate aree tacere e unsilenced e comparativa profili di espressione genica determinata dalla quantitativa real-time RT-PCR. Abbiamo dimostrato che questo metodo può essere efficacemente applicato per trascrittomica accurata di sottoinsiemi di cellule all'interno dei dischi immaginale Drosophila. Infatti, mentre la preparazione del disco di massa come fonte di RNA assume generalmente omogeneità cellulare, è ben noto che l'espressione trascrizionale può variare notevolmente all'interno di queste strutture a seguito di informazioni di posizione. Utilizzando localizzato segnale fluorescente GFP per guidare taglio laser, analisi trascrizionale più accurata può essere eseguita e proficuamente applicati alle domande più disparate, tra cui profili trascrizione di linee cellulari distinte nel loro contesto d'origine.

Protocol

Parte 1. Preparazione di Drosophila Dischi Ala immaginale Sottoposto a specifico e localizzato RNAi.

Come materiale biologico, abbiamo usato Drosophila dischi ala immaginale ottenuti da larve transgeniche sottoposto al silenziamento del gene localizzato e specifico per mezzo del sistema GAL4/UAS ^1. Questa progenie larvale orginates da un incrocio genetico che coinvolge due linee parentali: uno porta la conducente GAL4, il secondo il risponditore SUP. Oltre ad esprimere GAL4 nel modello temporale specifico e / o spaziali, la linea pilota porta una SUP-GFP giornalista che permette di visualizzare il dominio GAL4 espressione. La linea UAS risponditore esprime, sotto il controllo della sequenza UAS, un tornante silenziamento dell'RNA (hpRNA) in grado di indirizzare specificamente il gene di interesse selezionati (lo chiamano gene X) ^2. Una volta espressa nella cellula, l'X è hpRNA spaccati di generare piccoli RNA interferenti (siRNA) in grado di mettere a tacere specificamente il gene selezionato. Nella progenie larvale, che porta entrambi i driver e risponditore transgeni, le scuole universitarie professionali di silenziamento costrutto è solo trascritto in quelle cellule che esprimono la proteina GAL4, ed è quindi in grado di indurre un silenziamento spazialmente limitato del gene X. selezionato

Tra le varietà di possibili applicazioni, abbiamo applicato questo metodo per silenziare un gene selezionato di nostro interesse (gene X) sotto il controllo del engrailed-GAL4 (it) driver, che può innescare silenziamento specifici nel vano posteriore del disco ala ³ , il cui territorio è stato caratterizzato da l'espressione del transgene UAS-GFP.

I dischi silenziati ala immaginale sono stati sezionati a mano, avendo cura di eliminare i tessuti circostanti contaminanti, soprattutto i tracheas aderenti. Ogni disco ala isolato è stato poi rapidamente e delicatamente trasferito in un precedentemente trattati, telaio dissezione RNasi gratuito per microdissezione laser immediata di aree selezionate.

Parte 2. Microdissezione laser delle aree selezionate dal silenzio (posteriore) e unsilenced (anteriore) comparti del disco ala.

Una volta che il disco ala era sulla membrana, microdissezione laser delle aree specifiche di tacere (posteriore; GFP-etichetta) e unsilenced (anteriore; GFP-senza etichetta) i compartimenti è stato raggiunto. Questo disegno è stato eseguito da una zona che potrebbe essere facilmente inserito in entrambi i lati GFP-positive e GFP-negativi del disco. Sotto la microdissector, per prima cosa focalizzato il fascio laser sul tessuto GFP-positive, effettuando un taglio lungo il perimetro selezionato. Il ricavato microdissector con taglio alla velocità selezionata e potere, ma è possibile affinare il taglio manuale, fino a quando l'area selezionata del tessuto cade nel tubo sottostante. Questo tubo contiene un piccolo volume di TRI Reagent, in modo che la GFP-positive tessuto è pronto per la successiva estrazione di RNA.

Successivamente abbiamo spostato la zona di taglio per il contrario, GFP-negativi lato del disco ala, al fine di analizzare un territorio equivalente dal unsilenced, GFP-negativi tessuti. Ancora una volta, dopo il taglio automatico, si è proceduto a perfezionare il taglio manualmente. Una volta che il taglio è stato fatto, anche la GFP-negativa del tessuto è stato recuperato nelle TRI Reagent, pronto per l'estrazione di RNA.

Parte 3. RNA Estrazione e Profiling Trascrizione da aree di tessuto microdissezionate.

Abbiamo girato per staccare i tubi del liquido dal tappo e ha aggiunto TRI Reagent fino a 1 ml, quindi eseguita l'estrazione di RNA seguendo il protocollo standard di TRI Reagent. Per raccogliere materiale sufficiente, abbiamo ripetuto la procedura di taglio sui 100 dischi ala immaginale. A partire da 100 aree di circa 5000 micron ² ciascuno, il nostro rendimento è stato di 1,5 mg di RNA. Precisione della dissezione manuale è stato poi controllato controllando espressione GFP nei campioni di tacere e unsilenced mediante RT-PCR, utilizzando Super Script III (Invitrogen) per sintetizzare cDNA con esameri casuali. Successive analisi quantitative focalizzate per determinare i livelli di espressione del gene X a tacere, insieme a quelle di target putativi del suo percorso normativo, sono state eseguite da Real Time RT-PCR utilizzando Master Mix (Invitrogen).

Discussion

Per quanto riguarda i loro livelli di espressione basale raggiunti negli scompartimenti anteriore / posteriore dei dischi ala unsilenced, l'attività del gene X selezionato è stato trovato ridotto al 40% alla tacere. Al contrario, uno dei suoi obiettivi putativi (geni Y) è stata trovata significativamente up-regolati (7 volte-aumento), che ci porta a convalidare l'ipotesi che fosse regolato negativamente dal gene X.

Concludiamo che l'approccio sperimentale sopra descritto può essere applicato con successo la validazione dei target putativi di diversi percorsi di regolamentazione.

Inoltre, supponiamo che il miglioramento del rendimento di estrazione di RNA potrebbero rapidamente permettere la caratterizzazione dei profili di trascrizione localizzato mediante l'analisi microarray. Si aprirà la possibilità di ottenere una visione più dettagliata di importanti processi biologici. Per esempio, la formazione localizzata di gradienti morfogenetici ^{4, 5} o l'interruttore trascrizionale sottolineando il processo di concorrenza ⁶ celle, in cui perdere e cloni di cellule vincitore può essere visualizzato espressione differenziale GFP, potrebbe essere più specificatamente. Qualunque sia l'applicazione, questo approccio può aiutare a definire la risposta trascrizionale di diversi territori cellulari nel loro contesto tessuto nativo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).