Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

Summary

Microdissecção a laser foi aplicado para analisar perfil de expressão gênica em compartimentos específicos de Drosophila disco asa submetido a RNAi localizada

Abstract

Heterogeneidade de tecidos tem provado ser um fator limitante na quantidade de informações que podem ser gerados a partir de amostras biológicas, comprometendo análises a jusante. Considerando-se as associações complexas e dinâmicas celulares existentes dentro muitos tecidos, a fim de recapitular a nas interações vivo análise minuciosa molecular é preciso ser capaz de analisar populações de células específicas dentro de seu contexto nativo. Laser mediada por microdissecção pode alcançar este objetivo, permitindo uma identificação inequívoca e colheita bem-sucedida de células de interesse sob visualização microscópica direta, mantendo a integridade molecular. Temos aplicado esta tecnologia para analisar a expressão de gene dentro das áreas definidas do desenvolvimento de Drosophila disco asa, o que representa um sistema modelo para estudar vantajoso controlar o crescimento, diferenciação celular e organogênese. Larval discos imaginais são precocemente subdividida em compartimentos anterior e posterior, dorsal e ventral por fronteiras restrição linhagem. Fazendo uso da induzível GAL4-UAS sistema de expressão de binário, cada um desses compartimentos podem ser rotulados especificamente em moscas transgênicos expressando um transgene UAS-GFP sob o controle do driver apropriado GAL4 construir. Nos discos transgênicos, perfil de expressão gênica de subconjuntos discretos de células pode ser determinada precisamente após laser-mediada microdissecção, usando o sinal fluorescente GFP para guia de corte a laser.

Entre a variedade de aplicações a jusante, nos concentramos em RNA perfil transcrição localizada após interferência de RNA (RNAi). Com o advento da tecnologia de RNAi, GFP rotulagem podem ser acoplados com knockdown localizada de um determinado gene, o que permite determinar a resposta transcricional de uma população de células discretas para o silenciamento de genes específicos. Para validar esta abordagem, dissecamos áreas equivalentes do disco do posterior (rotulada pela expressão GFP), eo compartimento (sem identificação) anterior ao silenciamento regionais no compartimento de P de um gene de outra forma ubiquitously expressa. RNA foi extraído de microdissecção áreas silenciadas e unsilenced e perfil de expressão gênica comparativa determinado pelo quantitativo em tempo real, RT-PCR. Nós mostramos que este método pode ser aplicado de forma eficaz para transcriptômica precisa de subconjuntos de células dentro dos discos Drosophila imaginal. De fato, enquanto a preparação do disco massivo como fonte de RNA geralmente assume homogeneidade celular, é bem sabido que a expressão transcricional pode variar muito dentro dessas estruturas em conseqüência da informação posicional. Usando o sinal fluorescente GFP localizada a guia de corte a laser, mais precisas análises de transcrição pode ser realizada e rentável aplicado a diferentes aplicativos, incluindo perfis de transcrição de linhagens celulares distintas dentro de seu contexto nativo.

Protocol

Parte 1. Preparação de discos Drosophila Asa Imaginal Sujeitos a RNAi específica e localizada.

Como material biológico, foram utilizados discos de Drosophila asa imaginal obtido a partir de larvas transgênicas submetidas ao silenciamento de genes localizados e específicos, por meio do sistema GAL4/UAS ^1. Esta progênie larval orginates de um cruzamento genético envolvendo duas linhas parentais: uma carregando o driver GAL4, o segundo a responder UAS. Além de expressar GAL4 no padrão temporal específica e / ou espacial, a linha do driver carrega um repórter UAS-GFP, que permite visualizar a expressão de domínio GAL4. A linha de resposta UAS expressa, sob o controle da seqüência UAS, um hairpin silenciamento de RNA (hpRNA) capaz de visar especificamente o gene de interesse seleccionados (chamemos-lhe gene X) ^2. Uma vez expresso na célula, o X hpRNA é clivada para gerar pequeno RNA de interferência (siRNA) capaz de silenciar o gene especificamente selecionados. Na progênie larval, que leva o condutor e responder transgenes, a construção UAS silenciar só é transcrito nas células que expressam a proteína GAL4 e, portanto, é capaz de induzir um silenciamento espacialmente restrita do gene selecionadas X.

Entre a variedade de aplicações possíveis, aplicou-se esta abordagem para silenciar um gene selecionado de nosso interesse (gene X) sob o controle do engrailed-GAL4 (en) driver, que pode desencadear o silenciamento específico no compartimento posterior do disco ala de ³ , cujo território foi marcado pela expressão do transgene UAS-GFP.

O silenciados discos asa imaginal mão-foram dissecados, tendo o cuidado de eliminar tecidos circundantes contaminação, especialmente a traquéia aderir. Cada disco ala isolada foi então rapidamente e delicadamente transferido para um, RNase previamente tratados quadro dissecção livre para microdissecção a laser imediata de áreas selecionadas.

Parte 2. Microdissecção a laser de áreas selecionadas a partir do silêncio (posterior) e unsilenced (anterior) compartimentos do disco asa.

Uma vez que o disco foi asa na membrana, microdissecção a laser de áreas específicas de silenciados (posterior; GFP-rotulados) e unsilenced (anterior; GFP-unlabelled) compartimentos foi alcançado. Este desenho foi realizado por uma área que poderia se encaixar facilmente em ambos, os lados positivos e GFP-GFP-negativos do disco. Sob a microdissector, primeiro foco do raio laser sobre o tecido GFP-positivo, fazendo um corte ao longo do perímetro selecionado. O produto microdissector com corte na velocidade selecionada e poder, mas é possível refinar o corte manualmente, até que a área selecionada de tecido cai no tubo embaixo. Este tubo contém um pequeno volume do Reagente TRI, de modo que o tecido GFP-positivo está pronto para a extração de RNA subseqüentes.

Nós posteriormente mudou-se a área de corte para o oposto, GFP-negativos lado do disco asa, a fim de dissecar um território equivalente a partir da unsilenced, tecido GFP-negativos. Mais uma vez, após o corte automático, procedeu-se a refinar o corte manual. Uma vez que o corte foi feito, também o tecido GFP-negativos foi recuperada na Reagente TRI, pronto para a extração de RNA.

Parte 3. A extração de RNA e perfil de transcrição de Áreas Tissue microdissecção.

Nós girou os tubos para separar o líquido do cap e acrescentou Reagente TRI até 1 ml, então realizada extração de RNA, seguindo o protocolo padrão Reagente TRI. Para coletar material suficiente, nós repetimos o procedimento de corte em 100 discos de asa imaginal. A partir de 100 áreas de cerca de 5000 M ² cada, nosso rendimento foi de 1,5 microgramas de RNA. Precisão da dissecção manual foi então controlado por verificação expressão GFP nas amostras silenciadas e unsilenced por RT-PCR, usando Super Script III (Invitrogen) para sintetizar cDNA com hexâmeros Random. Subseqüentes análises quantitativas focado para determinar os níveis de expressão do gene X silenciado, juntamente com os dos alvos putativos de sua via de regulamentação, foram realizadas por Real Time RT-PCR usando Master Mix (Invitrogen).

Discussion

Em relação aos seus níveis de expressão basal alcançado nos compartimentos anterior / posterior da asa unsilenced discos, a atividade do gene X selecionada foi encontrado reduzidos para 40% sobre o silenciamento. Em contraste, um dos seus alvos putativos (genes Y) foi encontrada significativamente sobre-regulada (7 vezes maior), levando-nos para validar a hipótese de que ela foi regulada negativamente pelo gene X.

Concluímos que a abordagem acima descrita experimental pode ser aplicado com sucesso para a validação de alvos putativos de diversas vias regulatórias.

Além disso, supomos que a melhora no rendimento de extração de RNA poderia rapidamente permitem a caracterização do perfil de transcrição localizada pela análise de microarray. Isso abrirá a possibilidade de alcançar uma visão mais detalhada dos processos biológicos importantes. Para exemplos, a formação localizada de gradientes morfogenéticos ^{4, 5} ou o interruptor de transcrição salientando o processo de concorrência de ⁶ células, onde perder e clones de células vencedor pode ser visualizado pela expressão GFP diferencial, pode ser dirigida mais especificamente. Seja qual for a aplicação, essa abordagem pode ajudar a definir a resposta transcricional dos diferentes territórios celulares em seu contexto tecido nativo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).