から細胞のサブセットの遺伝子発現プロファイリングへの応用レーザーマイクロダイセクションショウジョウバエウィングディスク

Summary

レーザーマイクロダイセクションは、ローカライズされたRNAi実験に供ショウジョウバエの翅のディスクの特定のコンパートメントでの遺伝子発現プロファイリングの解析に適用した

Abstract

組織の均質性は、ダウンストリームの解析を犠牲にすること、生体試料から生成することができる情報量の制限要因であることが証明されている。多くの組織内に存在する複雑で動的な細胞の関連を考えると、 生体の相互作用における徹底的な分子分析を再現するために、ひとつは、ネイティブのコンテキスト内で特定の細胞集団を分析することができなければなりません。レーザーを介したマイクロダイセクションでは、分子整合性を維持しながら、直接顕微鏡可視化の下で目的の細胞が明確に識別し、成功した収穫を可能にする、この目標を達成することができます。規模の大小、成長制御、細胞分化や器官形成を研究するために有利なモデルシステムを表す開発ショウジョウバエの翅のディスク、の定義の領域内の遺伝子発現を分析するためにこの技術を適用している。幼虫成虫ディスクは、早期に系統限定の境界によって前部と後部、背側と腹側の区画に分割されています。誘導GAL4 - UASバイナリ発現系を利用して、これらの区画の各々が特異的トランスジェニックで標識することができる構築GAL4 -ドライバ適切なの制御下にUAS - GFP遺伝子を発現するハエ。トランスジェニックディスクでは、細胞の離散部分集合の遺伝子発現プロファイリングは正確にレーザーカットを導くために蛍光GFPのシグナルを使用して、レーザーを介したマイクロダイセクションの後に決定することができます。

下流の様々なアプリケーションの中で、我々は、ローカライズされたRNA干渉（RNAi）の後にRNA転写物プロファイリングに焦点を当てた。 RNAi技術の出現により、GFP標識は、特定の遺伝子サイレンシングに離散的細胞集団の転写応答を決めるかもできるように、与えられた遺伝子のローカライズされたノックダウンと組み合わせて使用​​することができます。このアプローチを検証するために、我々は（GFPの発現で標識された）後からディスクに相当する領域を解剖し、それ以外の場合は遍在的に発現する遺伝子のP区画の地域サイレンシング時に前方（非標識）コンパートメント。 RNAは、マイクロダイセクション沈黙とunsilencedエリアと定量的リアルタイムRT - PCRによって決定される比較の遺伝子発現プロファイリングから抽出した。我々はこの方法が効果的にショウジョウバエ成虫のディスク内の細胞のサブセットの正確なトランスクリプトームに適用できることを示している。 RNAの源として巨大なディスクの準備が一般に細胞の均質性を前提としながら、実際、、それが転写発現は、位置情報の結果では、これらの構造の中で大きく変化することはよく知られています。レーザーカットを導くためにローカライズされた蛍光GFPのシグナルを使用して、より正確な転写解析を実施し、収益性の高い、ネイティブのコンテキスト内の異なる細胞系譜の転写産物プロファイリングなど、複数の異なるアプリケーションに適用することができる。

Protocol

パート1。特定とローカライズRNAiのを受けるショウジョウバエ成虫ウィングディスクの調製。

生体物質として、GAL4/UASシステム¹によりローカライズと特定遺伝子サイレンシングにさらさトランスジェニック幼虫から得ショウジョウバエ成虫ウィングディスクを使わ。 GAL4ドライバ、第二UASレスポンダを運ぶOne：この幼虫子孫は2親系統が関与遺伝クロスからorginates。特定時間的及び/または空間パターンでGAL4を表現する加え、ドライバラインはGAL4発現ドメインを視覚化できるUAS - GFPレポーターを運びます。 UASレスポンダラインは、UASシーケンスの制御下、特に関心の選択遺伝子（呼び出しそれ遺伝子^X）2をターゲットできなけれRNA（hpRNAを）サイレンシングヘアピンを表現。かつて細胞で発現、hpRNA Xは特に選択遺伝子を黙らできなけれ小さな干渉RNA（siRNAを）生成する切断さ。ドライバとレスポンダ導入遺伝子両方を運ぶ幼虫子孫、で、UAS -サイレンシングコンストラクトはのみGAL4タンパク質を発現それら細胞で転写、およびこうして選択遺伝子X.の空間的制限サイレンシングを誘導できなけれですさ

可能さまざまなアプリケーション中でも、我々は縁をギザギザにした - GAL4の制御下たち関心の選択遺伝子（遺伝子X）（EN）ドライバ、翼ディスク³の後部コンパートメントで特定サイレンシングをトリガできます無音にこのアプローチを適用、テリトリーUAS - GFPトランスジーンの発現によってマークれました。

沈黙成虫翼ディスクは、手作業-解剖特に汚染組織、付着気管を取り巻く排除するケアを取っていた。各孤立翼ディスクはその後迅速かつ優しく選択区域の即時レーザーマイクロダイ用既治療、RNaseフリー解剖フレームへ移した。

パート2。翼ディスクの沈黙（後部）とunsilenced（前方）コンパートメントから選択した領域のレーザー顕微解剖。

とunsilenced（前方; GFP -非標識）コンパートメントが達成れた;いったん翼ディスクは沈黙（GFP標識後部）から特定領域のレーザー顕微解剖は、メンブレンにあった。このは容易両方に収まるエリア、ディスクのGFP陽性とGFP -負両側を描画によって行った。 microdissector下、まず選択周囲沿っカットを作る、GFP陽性組織上レーザービームを焦点。 microdissector選択スピードとパワーで切削進めます、しかし組織の選択面積が下チューブで下がるまでそれは、手動カッティングを絞り込むことです。このチューブはGFP陽性組織が後続RNA抽出の準備なるよう。、TRI試薬の小さな容積を含みます

当社はその後unsilenced、GFP -負組織から同等領土を解剖ために、翼ディスクの反対、GFP -負側に切削領域を移さ。もう一度、自動カット後、とりあえず手動カットを精製に進んだ。カットが行われたいったん、またGFP -負組織はRNA抽出用準備、TRI試薬で回収した。

第3部。マイクロダイセクションティッシュエリアからRNA抽出と転写プロファイリング。

当社はキャップから液体をデタッチするチューブをスピンし1mlにTRI試薬を加算、その後標準TRI試薬プロトコル続くRNA抽出を行わ。十分材料を収集する、我々は100成虫翼ディスク上カッティング手順を繰り返した。約^{5000μm2である}各の100分野から始まる、たち収量はRNA1.5μgのであった。マニュアル解剖の精度はその後ランダムヘキサ持つcDNAを合成スーパースクリプトIII（インビトロジェンを）用いた、RT - PCRによる沈黙とunsilencedサンプルでGFP発現をチェックによって制御れました。その規制経路の推定標的のそれらと共に、沈黙遺伝子Xの発現レベルを決定する焦点後続定量分析は、マスターミックス（インビトロジェンを）用いたRT - PCRリアルタイムによって行った。

Discussion

unsilenced翼ディスクの前部/後部コンパートメントで達成されたそれらの基底レベルの発現量を基準にして、選択された遺伝子のXの活動は、サイレンシング時に40％に減少が見出された。対照的に、その推定ターゲット（遺伝子Y）のいずれかで、私たちはそれが否定的に遺伝子Xによって規制されているという仮説を検証するためにつながる、（7倍 - 増）が大幅にアップレギュレートを発見された

我々は、上述の実験的アプローチが正常に様々な調節経路の推定ターゲットの検証に適用できると結論付けている。

さらに、我々は、RNA抽出の収率の改善が急速にマイクロアレイ解析によりローカライズされた転写プロファイリングの特性評価を可能にすることができると推測。これは重要な生物学的プロセスのより詳細なビューを達成する可能性を開きます。例については、形態形成の勾配^4,5、または失うと勝者の細胞クローンは、差動のGFPの発現を可視化することができる細胞の競争⁶のプロセスを下線転写スイッチのローカライズ形成は、より具体的に対処することができます。どのようなアプリケーション、このアプローチは、彼らのネイティブ組織のコンテキストで異なる携帯電話地域の転写応答を定義することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).