Лазерная микродиссекция Применительно к экспрессии генов Профилирование подмножество ячеек из Drosophila Крыло диска

Summary

Лазерная микродиссекции была применена для анализа профилей экспрессии генов в определенных отсеках крыла Drosophila диск подвергается локализованных RNAi

Protocol

Часть 1. Подготовка дрозофилы имагинальных крыла диски подвергнутого конкретные и локализованных РНК-интерференции.

Как биологический материал, мы использовали дрозофилы имагинальных крыло диски полученные из трансгенных личинки подвергаются локализованы и конкретных генов с помощью системы GAL4/UAS ^1. Это личиночная потомства orginates от генетических крест с участием двух родительских линий: один несет GAL4 водителя, второй UAS ответчик. Кроме того, чтобы выразить GAL4 в шаблоне конкретных временных и / или пространственное, пилотов несет UAS-GFP репортеру, что позволяет визуализировать GAL4 выражение домена. Линия UAS ответчик заявляет, под контролем последовательности UAS, шпильки глушителей РНК (hpRNA), способных непосредственно для выбранного гена (назовем его ген Х) ^2. После экспрессии в клетке, hpRNA X расщепляется для создания малых интерферирующих РНК (миРНК), способных специально молчание выбранных генов. В личиночной потомство, которое несет водителя и ответчик трансгенов, UAS-глушителей построить только транскрибируется в тех клеток, экспрессирующих белок GAL4, и таким образом может вызвать пространственно ограниченных молчание выбранный ген X.

Среди множества возможных применений, мы применили этот подход, чтобы заставить замолчать выбран ген наш интерес (ген X) под контролем engrailed-GAL4 (англ.) драйвер, который может вызвать определенный глушителей в заднем отсеке крыла диск ³ , на территории которого был отмечен выражением UAS-GFP трансгена.

Замолчать имагинальных дисков крыла были ручной рассеченные, заботясь, чтобы ликвидировать загрязнение окружающей ткани, особенно придерживаясь трахеи. Каждый диск изолированных крыла была затем быстро и аккуратно переданы ранее получавших лечение, РНКазы свободных кадров для немедленного вскрытия микродиссекции лазерной отдельных областях.

Часть 2. Лазерная микродиссекции отдельных районах от замолчать (задняя) и unsilenced (передний) отсеков крыла диска.

Как только крыло диск был на мембране, лазерная микродиссекции конкретных областях от замолчать (задняя; GFP-меченых) и unsilenced (передний, GFP-немеченого) отсеков была достигнута. Это был выполнен рисунок области, которые могли бы легко поместиться в обоих, GFP-положительных и GFP-отрицательные стороны диска. Под microdissector, мы сначала сосредоточены лазерный луч на GFP-положительных ткани, делая разрез вдоль выбранного периметру. Microdissector продолжает резки на выбранной скорости и мощности, но это можно уточнить резка вручную, до выбранной области ткани попадает в трубку внизу. Эта трубка содержит небольшой объем TRI реагентом, таким образом, что GFP-положительных ткань готова к последующей экстракции РНК.

Впоследствии мы переехали лесосеки на противоположную, GFP-отрицательные стороны крыла диск, для того, чтобы рассекать эквивалентную территорию от unsilenced, GFP-отрицательные ткани. Еще раз, после автоматического отключения, мы приступили к переработке вырезать вручную. После разреза было сделано, и GFP-отрицательные тканей было обнаружено в TRI реагент, готовый для добычи РНК.

Часть 3. Добыча и РНК Транскрипция профилирования из микродиссекции участков ткани.

Мы нити трубы, чтобы отделить жидкость от шапки и добавил TRI реагентом до 1 мл, а затем производится экстракция РНК в соответствии со стандартным протоколом TRI реагентом. Чтобы собрать достаточно материала, мы повторили процедуру резки на 100 имагинальных дисков крыла. Начиная от: 100 районов примерно 5000 мкм ² каждый наш выход был в 1,5 мкг РНК. Точность ручной рассечение было тогда контролируется проверкой GFP выражение в замолчать и unsilenced образцов RT-PCR, используя супер Сценарий III (Invitrogen) для синтеза кДНК со случайными гексамеров. Последующие количественного анализа сосредоточены, чтобы определить уровни экспрессии гена замолчать X, вместе с теми, предполагаемых целей своих регулирующих пути, были выполнены в режиме реального времени RT-ПЦР с использованием Master Mix (Invitrogen).

Discussion

Что касается их основной уровень экспрессии, достигнутые в передних / задних отсеков unsilenced диски крыло, активность выбранных X ген был обнаружен снижается до 40% от глушителя. В отличие от этого, одним из ее предполагаемых мишеней (генов Y) было найдено значительное до регулируемой (7 раз-увеличение), что приводит нас к проверке гипотезы, что это негативно регулируется геном X.

Мы заключаем, что описанные выше экспериментальный подход может успешно применяться для проверки предполагаемых целей различных нормативных путей.

Кроме того, мы предполагаем, что повышение доходности добычи РНК может быстро позволяют характеристики локализованных профилирования транскрипции микрочипов анализа. Это откроет возможности для достижения более детальное представление о важных биологических процессов. Для примера, локализованные образования морфогенетические градиенты ^{4, 5} или транскрипционные переключатель подчеркнув процессе клеточного конкуренции ^6, где потери и клонов победителем ячейка может быть визуализированы дифференциального выражения GFP, может быть, более конкретно решать. Что бы ни применение, этот подход может помочь в определении транскрипционной реакции различных клеточных территорий на их родном контексте ткани.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).