Microdissection laser appliquée au profil d'expression génique de la Sous-ensemble de cellules provenant de la Drosophile Wing disque

Summary

Microdissection laser a été appliquée pour analyser les profils d'expression génique dans des compartiments spécifiques de la drosophile aile disque soumis à localisées ARNi

Abstract

Nature hétérogène des tissus s'est avérée être un facteur limitant dans la quantité d'informations qui peuvent être générés à partir d'échantillons biologiques, ce qui compromet les analyses en aval. Considérant les associations complexes et dynamiques cellulaires existant dans de nombreux tissus, afin de récapituler les interactions in vivo analyse approfondie moléculaires on doit être capable d'analyser les populations cellulaires spécifiques au sein de leur contexte d'origine. Laser à médiation microdissection pouvons atteindre cet objectif, permettant l'identification non ambiguë et bonne récolte de cellules d'intérêt sous visualisation microscopique direct tout en conservant l'intégrité moléculaire. Nous avons appliqué cette technologie pour analyser l'expression génique dans des zones définies du disque de développement chez la drosophile aile, ce qui représente un système modèle avantageux pour étudier le contrôle de croissance, la différenciation cellulaire et l'organogenèse. Larves disques imaginaux sont précocement subdivisé en compartiments antérieur et postérieur, dorsale et ventrale par des frontières restriction lignée. Faisant usage de l'inductible GAL4 UAS-système d'expression binaire, chacun de ces compartiments peuvent être spécifiquement étiquetés mouches transgéniques exprimant un transgène UAS-GFP sous le contrôle du pilote approprié GAL4-construire. Dans les disques transgéniques, le profilage d'expression génique de sous-ensembles distincts de cellules peut être précisément déterminé après microdissection laser médiation, en utilisant le signal GFP fluorescentes pour guider découpées au laser.

Parmi la variété d'applications en aval, nous nous sommes concentrés sur les profils de transcription ARN après localisée interférence ARN (ARNi). Avec l'avènement de l'ARNi de la technologie, la GFP étiquetage peut être couplé avec knockdown localisée d'un gène donné, permettant pour déterminer la réponse transcriptionnelle d'une population cellulaire discrète à l'inactivation des gènes spécifiques. Afin de valider cette approche, nous disséqué zones équivalentes du disque de la partie postérieure (marqué par l'expression de GFP), et la partie antérieure (sans étiquette) du compartiment à faire taire régionale dans le compartiment d'un gène P contraire exprimée de manière ubiquitaire. L'ARN a été extrait de microdissection des zones réduites au silence et unsilenced et comparative du profil d'expression génique déterminé par quantitative en temps réel RT-PCR. Nous montrons que cette méthode peut être effectivement appliquée pour la transcriptomique précise des sous-ensembles de cellules au sein des disques imaginaux chez la drosophile. En effet, tandis que la préparation du disque massifs comme source d'ARN suppose généralement l'homogénéité des cellules, il est bien connu que l'expression transcriptionnelle peut varier considérablement au sein de ces structures à la suite d'informations de position. En utilisant le signal GFP fluorescentes localisées au guide de coupe au laser, plus précis analyses transcriptionnelles peuvent être réalisées et rentable appliqué à des applications disparates, y compris les profils de transcription des lignées cellulaires distinctes au sein de leur contexte d'origine.

Protocol

Partie 1. Préparation de disques drosophile Wing Imaginal Soumis à l'ARNi spécifiques et localisées.

Comme matériel biologique, nous avons utilisé des disques imaginaux aile drosophile obtenue à partir de larves transgéniques soumises à l'inactivation des gènes localisés et spécifiques par le biais du système GAL4/UAS ^1. Cette descendance larvaire orginates d'un croisement génétique impliquant deux lignées parentales: l'un portant le pilote GAL4, le second le répondeur SAMU. En plus d'exprimer GAL4 dans le modèle une temporels spécifiques et / ou spatiale, la ligne du pilote effectue un journaliste UAS-GFP qui permet de visualiser le domaine de GAL4 expression. La ligne de SAU répondeur exprime, sous le contrôle de la séquence UAS, une épingle RNA silencing (hpRNA) capable de cibler spécifiquement le gène d'intérêt sélectionnés (appelons-le gène X) ^2. Une fois exprimée dans la cellule, le X hpRNA est clivé pour générer de petits ARN interférents (siRNA) capable de taire les gènes spécifiquement sélectionnés. Dans la descendance des larves, qui transporte le conducteur et le répondeur transgènes, la construction SAMU-taire est seulement transcrit dans les cellules exprimant la protéine GAL4, et est donc capable d'induire une silençage spatialement restreinte du gène sélectionné X.

Parmi la variété des applications possibles, nous avons appliqué cette approche pour réduire au silence un gène choisi de notre intérêt (gène X) sous le contrôle de l'engrailed-GAL4 (fr) conducteur, qui peut déclencher taire spécifique dans le compartiment postérieur du disque aile ³ , dont le territoire a été marquée par l'expression du transgène UAS-GFP.

Les disques ont été réduits au silence l'aile imaginale main disséquée, en prenant soin d'éliminer les tissus environnants contaminant, en particulier les trachées adhérents. Chaque disque aile isolée a ensuite été transféré rapidement et en douceur à un précédemment traités, cadre RNase dissection gratuit pour microdissection laser immédiate des zones sélectionnées.

Partie 2. Microdissection laser des zones sélectionnées à partir du silence (postérieure) et unsilenced (antérieure) compartiments du disque aile.

Une fois le disque d'aile a été sur la membrane, microdissection laser des zones spécifiques du silence (postérieure; GFP-étiquetée) et unsilenced (antérieure; GFP-étiquetés) compartiments a été atteint. Ce dessin a été réalisé par une zone qui pourrait facilement s'insérer dans les deux, les côtés positifs GFP et GFP-négatif du disque. Sous la microdissecteur, nous avons d'abord concentré le faisceau laser sur les tissus GFP-positives, faisant une coupe le long du périmètre choisi. Le produit microdissecteur avec la coupe à la vitesse sélectionnée et le pouvoir, mais il est possible d'affiner le découpage à la main, jusqu'à ce que la zone sélectionnée de tissu tombe dans le tube en dessous. Ce tube contient une petite quantité de réactif TRI, de sorte que le tissu GFP-positives est prêt pour l'ARN extraction ultérieure.

Nous avons ensuite déplacé la zone de coupe à l'opposé, la GFP-négatif côté du disque d'aile, afin de disséquer un territoire équivalent de la unsilenced, GFP-négative des tissus. Une fois encore, après la coupe automatique, nous avons procédé à l'affinage du coupé manuellement. Une fois que la coupe a été faite, aussi le tissu GFP-négative a été récupéré dans le réactif TRI, prêt pour l'extraction de l'ARN.

Partie 3. Extraction d'ARN et de profilage de transcription à partir des zones tissulaires microdisséquées.

Nous filé les tubes de détacher le liquide de la PAC et a ajouté Tri Reagent jusqu'à 1 ml, puis effectué l'extraction d'ARN suivant le protocole réactif TRI standard. Pour recueillir assez de matériel, nous avons répété la procédure de coupe sur les 100 disques imaginaux aile. A partir de 100 domaines d'environ 5000 um ² chacun, notre rendement a été de 1,5 ug d'ARN. Précision de la dissection manuelle a ensuite été contrôlée en vérifiant expression de la GFP dans les échantillons réduits au silence et unsilenced par RT-PCR, en utilisant de Super Script III (Invitrogen) pour synthétiser l'ADNc avec des hexamères aléatoires. Après analyses quantitatives consacrées à déterminer les niveaux d'expression de la gène X silence, avec ceux de cibles putatives de sa voie réglementaire, ont été effectués par Real Time RT-PCR en utilisant Mix Master (Invitrogen).

Discussion

En ce qui concerne leurs niveaux d'expression basale réalisés dans les compartiments antérieur / postérieur de l'aile unsilenced disques, l'activité du gène X sélectionnés a été trouvée réduite à 40% à faire taire. En revanche, une de ses cibles putatives (gènes Y) a été trouvée significativement régulée à la hausse (7 fois-augmentation), nous conduit à valider l'hypothèse qu'il était régulé négativement par le gène X.

Nous concluons que l'approche décrite ci-dessus expérimentales peuvent être appliqués avec succès à la validation de cibles putatives des diverses voies de régulation.

En outre, nous supposons que l'amélioration du rendement de l'extraction d'ARN pourrait rapidement permettre la caractérisation des profils de transcription localisé par analyse microarray. Cela ouvrira la possibilité d'obtenir une vue plus détaillée des processus biologiques importants. Pour des exemples, la formation localisée de gradients morphogénétiques ^{4, 5} ou le commutateur de la transcription en soulignant le processus de concurrence ⁶ cellules, où perdre et clones cellulaires gagnant ne peut être visualisé par l'expression différentielle GFP, pourraient être plus particulièrement abordée. Quel que soit l'application, cette approche peut aider à définir la réponse transcriptionnelle de différents territoires cellulaires dans leur contexte tissu natif.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC water	Sigma-Aldrich	W4502
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020
TRI Reagent	Sigma-Aldrich	T9424
SuperScript III	Invitrogen	18080093
Master Mix	Invitrogen	11761100
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Chloroform	Sigma-Aldrich	C7559
Dream taq	Fermentas	EP0701
Fly strains Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Drosophila UAS-silencing lines can be obtained from VDRC RNAi collection 2. A collection of GAL4-driver lines is available at the Bloomington Drosophila Stock Center (Indiana, USA). Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Equipment Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required equipment includes Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Tools Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).
Required tools include: glass wells, brush, microdissection forceps, hanging drop slides, insect pins mounted on syringe needles, metal frames with PET membrane, plastic tubes (50 ml, 05 ml, 0.25 ml).