Summary
بروتوكول يلي الخطوط العريضة لعملية تشريح البنكرياس للتصوير شريحة الظاهري ، والقياس الكمي لاحقة من جميع GFP الموسومة خلايا بيتا في البنكرياس بأكمله.
Abstract
تتبع التغيرات في خلية معينة من السكان في الصحة والمرض هو هدف مهم للبحوث الطبية الحيوية. عملية رصد انتشار خلايا بيتا في البنكرياس ، ونمو الجزيرة هو تحديا من نوع خاص. طورنا طريقة لالتقاط توزيع خلايا بيتا في البنكرياس سليمة من الفئران المعدلة وراثيا مع مضان الموسومة خلايا بيتا مع ماكرو مكتوبة لImageJ (rsb.info.nih.gov / ط /). بعد تشريح البنكرياس وتطهير الأنسجة ، ويتم التقاط البنكرياس بأسره شريحة افتراضية ، وبعد ذلك يتم فحص GFP الموسومة خلايا بيتا. ويشمل التحليل الكمي لمجموع عدد خلايا بيتا منطقة الجزيرة ، وتوزيع حجم مع الإشارة إلى معلمات وأماكن محددة لكل جزيرة ومجموعات صغيرة من خلايا بيتا. يمكن رسم توزيع كامل من الجزر في ثلاثة أبعاد ، والمعلومات عن توزيع على حجم وشكل كل جزيرة يسمح مقارنة كمية ونوعية التغيرات في مجال خلايا بيتا الشاملة في لمحة.
Protocol
الجزء 1 : إعداد العينات
- مكان ماوس تحت المجهر تشريح ، وإزالة كامل البنكرياس مع الاثني عشر والطحال لا تزال تعلق ، ومكان الأجهزة على شريحة زجاجية قبل زنه. إزالة الاثنى عشر عن طريق قطع النسيج الضام لها على طول الجانب ، حيث كان من المحتم أن البنكرياس. قطع وإزالة الطحال والدهون الزائدة في البنكرياس حتى يتم معزولة تماما البنكرياس على الشريحة. (الدهون البنكرياس تكون مميزة من خلال لونه أبيض ، ومتباينة من لون أغمق قليلا وتانر من نسيج البنكرياس).
- مكان ساترة (كبير يغطي زجاج 50x75mm ؛ القياسية تغطية 25x75mm الزجاج) على البنكرياس بحيث يغطي تماما عليه. استخدام الوزن (على سبيل المثال كتاب الثقيلة) إلى تسطيح البنكرياس بين الشرائح وغلافه. اعتمادا على الوزن ، وتسطيح البنكرياس يستغرق حوالي خمس دقائق.
- خلع الوزن. إذا البنكرياس جيدا بالارض ضد الشريحة ، وضعه في بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في 4 درجات مئوية خلال الليل. في الصباح ، وإزالة coverslips وفضح جيدا البنكرياس كله لمنهاج العمل خلال النهار (6-8 ساعات). إذا البنكرياس ليس جيدا ثابتة ، تسمح لها بالبقاء في منهاج العمل لفترة أطول ، وربما بين عشية وضحاها. نقل الشرائح إلى الحاوية مع 1 ٪ تريتون مخزنة X - 100 في الفوسفات الملحي (PBS) بين عشية وضحاها. اليوم التالي ، نقل الشرائح إلى الحاوية من السكروز المشبعة لمدة 1-2 أيام. ثم نقل الشرائح إلى وعاء يحتوي على الجلسرين 100 ٪ حتى يتم تطهير الأنسجة ، والذي يسمح لهذا القرار الأمثل للإشارات الفلورية ؛ تطهير الأنسجة يستغرق 1-3 أيام تقريبا. (قد اشارات الفلورسنت تستمر لأسابيع ، بل وأشهر ، ولكن يجب أن يتم تنفيذ التصوير بعد فترة وجيزة تم مسح الأنسجة لقرار الأمثل.)
- تخزين البنكرياس في منطقة مظلمة وباردة من أجل الحفاظ على الجهاز وإشاراته الفلورسنت.
الجزء 2 : التصوير وقياس منطقة بيتا في البنكرياس خلية سليمة
- باستخدام الملقط أو اليدين القفاز ، واتخاذ الشريحة خارج الحاوية مع الجلسرين بنسبة 100 ٪. تحضير الشرائح للتصوير بواسطة محو الجلسرين الزائدة وتنظيف حصرا الجزء الخلفي من غطاء زجاجي مع الايثانول.
- افتح البرنامج StereoInvestigator (MicroBrightField ، ويليستون ، VT) وحدد الهدف عدسة التصوير 2X عن الفئران بنكرياسات مضى عليها أكثر من 3 أسابيع على الشرائح الزجاجية الكبيرة ، أو لعدسة الهدف 10X الفئران التصوير بنكرياسات الذين تقل أعمارهم عن 3 أسابيع ضغط coverslips 25mm بين البلدين. تصور صورة عن طريق وضع لحية صورة (صورة → الصورة الحية). تحديد زمن التعرض أن يبين بوضوح GFP الموسومة خلايا بيتا. (صورة تعريض قليلا يستبعد أصغر الجزر وخلايا بيتا ، بينما overexposing يخلق صورة إشارات خاطئة إضافية).
- فوق أي مكان على الشاشة لإنشاء نقطة مرجعية ، والشروع في رسم كفاف حول البنكرياس بأكمله. بدء عملية شريحة الظاهري (صورة → اكتساب شريحة الظاهري). تحديد واختيار أفضل الطائرة أي اتصال ، وطائرة وفقا لأعلى عدد من الجزر وضوحا وتركيزا وخلايا بيتا على محور Z - التمرير بواسطة مقبض التركيز. المختار مرة واحدة ، StereoInvestigator يلتقط تلقائيا الصورة المعروضة على الشاشة. مع المرحلة الميكانيكي ، وميزة شريحة الظاهري يلتقط كل لوحة بالتسلسل كصورة بصرية متميزة داخل كفاف رسمها (الشكل 1A) ثم يجمع كل منهم صورة واحدة ودمج (الشكل 1B). الظاهري التصوير شريحة يستخدم التكوين epifluorescent أي widefield المرشحات التي تسمح للكاميرا لالتقاط جميع الإشارات الحالية على عمق معين ، بما في ذلك أولئك الذين لا تماما في التركيز ، حتى أن الشريحة النهائية الظاهري متكامل ثنائي الأبعاد الصورة التي ليست بحد أقصى الإسقاط من إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد في البنكرياس كله. متوسط مسح شريحة الظاهري الساعة 30 دقيقة لكل عينة ، ولكن يمكن أن يستغرق فترة تصل الى ساعة لالبنكرياس كبيرة.
- بعد حفظ الصورة ، ويبدأ تحليله من خلال فتح الصورة مع ImageJ. عند انتهاء تحميل الصور ويظهر على الشاشة ، وفتح وتشغيل التحليل الظاهري شريحة الماكرو ( مواد تكميلية 1 ).
- اتبع التعليمات خطوة بخطوة التي تقدمها الكلية. القضاء على القطع الأثرية التي أنشأتها مبعثر غير المرغوب فيه الضوء على "العصا السحرية" و "تحديد المنطقة" الأدوات. الاختيار لا لزوم لها وطرح خلفية من الصورة. تحديد دائرة نصف قطرها أكبر جزيرة باستخدام أداة "الخط" بحيث التي تلت ذلك ميزة الكرة المتداول يمكن أن يزيل بفعالية ضوء تألق ذاتي ومتناثرة. اختبار واختيار الأنسب "عتبة منخفضة" لالتقاط الاشارات الفلورسنت من الجزر الصغيرة ومجموعات من خلايا بيتا (<3x10 4 ميكرون 2). اختبار واختيار الأنسب "العتبة العليا" لالتقاط الاشارات الفلورسنت من الجزر. تشغيل الكمي لشريحة الظاهري ، والتي سوف قياسوتنتج لائحة منطقة الجزيرة ، المحيط ، دائرية ، وقطر في فيريه.
الشكل الظاهري شريحة 1A تحليل الصور لتوزيع كامل من خلايا بيتا في البنكرياس الكبار على حالها
صور لوحات ضوئية فردية لأحد الذكور في البنكرياس الماوس WK - 10 التي اتخذت في إطار هدف 2X. الصور تتضمن توزيع كامل من الجزر ، حتى كتل صغيرة من الخلايا بيتا (<10 خلايا).
صورة شخصية 1B شريحة الظاهري تحليل التوزيع الكلي للخلايا بيتا في البنكرياس الكبار على حالها
شريحة موحدة الظاهري مع البنكرياس الظهرية على اليمين والبنكرياس بطني على اليسار. شريط المقياس هو 5 ملم.
ممثل النتائج
ويتقن لإعداد البنكرياس للتصوير شريحة الظاهري السماح لالكمي الفعال لجميع GFP الموسومة خلايا بيتا في البنكرياس بأكملها كصورة شريحة الظاهري مع الجزر واضحة ومميزة. نجاح التصوير شريحة الظاهري البنكرياس كله في الموقع يوفر وسيلة لفحص وقياس خلايا بيتا ، وليس فقط منطقة الجزيرة الفردية والإجمالية ، ولكن أيضا جزيرة حجم التوزيع ، وتحليل الإقليمية ، وأنماط النمو كذلك. بينما ImageJ يحافظ على القدرة على كشف جميع خلايا بيتا في نفس الوقت في تحليل الصور شريحة الظاهرية ، فإنه يمكن أيضا التحكم فيها بيتا لتحديد الخلايا عن طريق تقييد التحليل على جزيرة أحجام معينة (حسب المنطقة أو القطر) ، أو عن طريق الموقع. تحليل المعيار يستبعد التحف على سبيل المثال ، أصغر من الحطام واحد خلايا بيتا (<170 ميكرون 2) والسجلات المنطقة المحيطة (المسافة المحيطة للمنطقة) ، دائرية (درجة من الاستدارة ، حيث يمثل 1.0 دائرة الكمال) ، واكتشفت في القطر فيريه (أطول مسافة داخل منطقة) لكل جزيرة. التحليل الظاهري شريحة قادرة على تعزيز الصور عن طريق استخدام شريحة الظاهري تجزئة مستجمعات المياه ، والذي يميز ويفصل الجزر تداخل في الجزر الفردية وفقا لأشكالها. تحليل تنتج المزيد من سلسلة من الصور التفصيلية ، وهذا يشمل أقنعة من الصور في إطار كل من كثافة منخفضة وعالية (الشكل 1C) ، مخططا لجميع الجزر المفترضة ، والتي هي كل مرقمة بشكل فردي والمدرجة في جدول معلومات المقابلة (الشكل . 1D) ، والصورة الأصلية شريحة الظاهري (الشكل 1B). علما بأن التحيز المحتمل التقنية عند اختيار القيم الحدية يمكن أن تحرف القياس الكمي من الجزر التي لا مبرر له بما في ذلك الضوء المحيطة هياكل كبيرة ، أو عن طريق الحد من عدد من الجزر ، وإشارات خافتة خصوصا من جسيمات صغيرة.
الشكل الظاهري شريحة 1C تحليل الصور لتوزيع كامل من خلايا بيتا في البنكرياس الكبار على حالها
قناع من الجسيمات الفلورية في شريحة الظاهري. رموز اللون : [1] الزرقاء : انخفاض كثافة مضان ؛ [2] الخضراء : كثافة متوسطة مضان ، و[3] الحمراء : مضان عالية الكثافة.
صورة شخصية 1D شريحة الظاهري تحليل التوزيع الكلي للخلايا بيتا في البنكرياس الكبار على حالها
الكمي من الجزر الفردية / مجموعات من خلايا بيتا. لاحظ أن يتم ترقيم كل جزيرة (بما في ذلك مجموعات صغيرة من خلايا بيتا) ، مع معلومات تفصيلية لها في مخطط المقابلة. تم القبض على اربعة المعلمات لكل هيكل : (1) المجال ؛ (2) محيط ؛ (3) دائرية : درجة من الاستدارة حيث العدد 1،0 يمثل دائرة كاملة ، و (4) فيريه والإطارات : أطول مسافة داخل المنطقة. علما بأن # 706 يعرض القرار تحليلات بمساحة فقط خلايا بيتا قليلة. تجزئة مستجمعات المياه بالكشف عن مجموعة من الجزر الصغيرة المجاورة لها ، مثل واحد هو مبين ، ويميز بشكل مناسب لهم كما الجزر مميزة (الجزر 1554 ، 1555 ، و 1556).
الشكل الظاهري شريحة 1E تحليل الصور لتوزيع كامل من خلايا بيتا في البنكرياس الكبار على حالها
3 الأبعاد مؤامرة لتحليل شريحة الظاهري ، مع محاور المنطقة المحيطة ، وقطر في فيريه. كل نقطة تمثل الجزيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل الصور الظاهري شريحة من الجزر ومجموعات خلايا بيتا في البنكرياس سليمة يقدم وجهة نظر واسعة النطاق لتوزيع كامل من الجزر. وبالتالي يمكن أن التطورات والتغيرات في توزيع مجموع جزيرة بمرور الوقت يمكن دراستها ومقارنتها. ويتجلى هذا مثلا في تحليلنا لتشكيل جزيرة البنكرياس (1). وقد أظهر تحليل شامل للبنكرياسات الفئران حديثي الولادة في نقاط زمنية مختلفة (P1 - P21) التي تتشكل الجزر بواسطة الانشطار. في حين بيتا تكاثر الخلايا يتناسب مع دالة كثافة الاحتمال lognormal في الفئران من P1 - P10 ، P12 جزيرة التوزيع من ينحرف بعيدا فصاعدا اليسار من نمط lognormal ، مما يشير إلى عملية الانشطار. وأجري تحليل مماثل على التنمية ورم جزيري التقدمية في الفئران ، والتي تركب وظيفة lognormal مع المعلمات للموقف الذروة ومقياس محور س ، وتوزيع قانون السلطة (2) : 
ف (س) = الفأس ذ. يتم تقديم البيانات بشكل فعال في قطع ثلاثية الأبعاد للمنطقة ، ومحيط قطرها فيريه في (الشكل 1E). لدراستنا ، الفئران المعدلة وراثيا ، والتي كانت موسومة وراثيا البنكرياس خلايا بيتا مع الاخضر الفلوريسنت (GFP ، 3 ، 4) البروتين استخدمت تحت سيطرة الانسولين الماوس أنا المروج (MIP). ويمكن أيضا MIP - GFP يمكن تجاوزها مع الفئران المعدلة وراثيا الأخرى المحددة في الدراسات المستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وتدعم هذه الدراسة من قبل الولايات المتحدة الصحة العامة خدمة المنح DK - 081527 ، 072473 وDK DK - 20595 لجامعة شيكاغو ومركز أبحاث السكري التدريب (الحيوان النماذج الأساسية) ، وهبة من مؤسسة أسرة Kovler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
