Summary
El protocolo siguiente se describe el proceso de disección del páncreas para obtener imágenes de corte virtual, y la posterior cuantificación de todas las buenas prácticas agrarias de etiquetado de las células beta en el páncreas.
Abstract
Seguimiento de los cambios de las poblaciones de células específicas en materia de salud y la enfermedad es un objetivo importante de la investigación biomédica. El proceso de monitoreo de páncreas de las células beta del islote proliferación y el crecimiento es particularmente difícil. Hemos desarrollado un método para capturar la distribución de las células beta en el páncreas intacto de ratones transgénicos con fluorescencia marcado las células beta con una macro escrita para ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). Después de la disección del páncreas y la limpieza de tejidos, todo el páncreas se captura como una rebanada virtual, después de que la GFP-etiquetados células beta son examinados. El análisis incluye la cuantificación del total de las células beta del islote número de área, y distribución de tamaño con respecto a los parámetros y lugares específicos para cada islote y para pequeños grupos de células beta. Toda la distribución de los islotes se pueden trazar en tres dimensiones, y la información de la distribución del tamaño y la forma de cada islote permite una comparación cuantitativa y cualitativa de los cambios en el total de superficie de las células beta de un vistazo.
Protocol
Parte 1: Preparación de Muestras
- Coloque un ratón bajo un microscopio de disección, extirpar el páncreas completo junto con el duodeno y el bazo están todavía atadas, y colocar los órganos en una placa de vidrio previamente pesado. Quitar el duodeno mediante la reducción de su tejido conectivo en el lado donde se une con el páncreas. Cortar y extirpar el bazo y el exceso de grasa en el páncreas hasta que el páncreas está completamente aislado en la diapositiva. (Grasa de páncreas se distingue por su color blanco, como se diferencian por el color ligeramente más oscuro y curtidor de tejido pancreático.)
- Coloque un cubreobjetos (cubierta de cristal grandes 50x75mm, 25x75mm estándar cubierta de vidrio) sobre el páncreas para que sea totalmente cubierta. Utilice un peso (por ejemplo, un libro pesado) para aplanar el páncreas entre la diapositiva y su cubierta. En función del peso, el aplanamiento del páncreas tarda aproximadamente cinco minutos.
- Sacar el peso. Si el páncreas está bien pegado a la diapositiva, el lugar en el 4% de paraformaldehído (PFA) a 4 ° C durante la noche. Por la mañana, quitar el cubreobjetos y así exponer el páncreas entero de PFA durante el día (6-8 horas). Si el páncreas no está bien fija, le permiten permanecer en la AFP más tiempo, posiblemente durante la noche. Transferencia de las diapositivas en el contenedor con 1% de Triton X-100 en tampón fosfato salino (PBS) durante la noche. Al día siguiente, la transferencia de las diapositivas en el contenedor de sacarosa saturada durante 1-2 días. A continuación, traslado de las diapositivas a un contenedor de 100% de glicerol hasta que el tejido se elimina, lo que permite la resolución óptima de las señales fluorescentes, en la limpieza del tejido lleva días aproximadamente 1-3. (Las señales fluorescentes pueden persistir durante semanas e incluso meses, pero las imágenes se debe realizar poco después de que el tejido está autorizado para una óptima resolución.)
- Guarde el páncreas en una zona oscura y fría con el fin de preservar el órgano y sus señales fluorescentes.
Parte 2: Imágenes y cuantificar el área de las células beta en el páncreas intacto
- El uso de pinzas o guantes, toma la diapositiva del envase con 100% de glicerol. Prepare la diapositiva de imágenes por limpiando el exceso de glicerol y exclusivamente la limpieza de la parte posterior de la cubierta de vidrio con etanol.
- Abra el software StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT) y selecciona la lente del objetivo 2x para los ratones de imágenes páncreas de más de 3 semanas en portaobjetos de vidrio grande, o la lente del objetivo 10x para los ratones de imágenes páncreas menores de 3 semanas presionado entre dos cubreobjetos de 25 mm. Visualizar la imagen seleccionado para vivir de la imagen (imagen → imágenes en vivo). Seleccione un tiempo de exposición que muestra claramente la GFP-etiquetados células beta. (Subexponiendo la imagen excluye pequeños islotes y las células beta, mientras que la sobreexposición de la imagen crea más señales falsas.)
- Haga clic en cualquier lugar de la pantalla para establecer un punto de referencia y proceder a dibujar un contorno alrededor de todo el páncreas. Iniciar el proceso de Cortar (imagen → Adquirir Cortar Virtual). Determinar y seleccionar el mejor ejemplo de plano focal, el avión con el mayor número de islotes visible y centrada y las células beta en el eje Z por el desplazamiento de la rueda de enfoque. Una vez elegido, StereoInvestigator captura automáticamente la imagen visualizada en la pantalla. Con la platina, la función de Cortar Virtual captura secuencial cada panel óptico como una imagen distinta en el contorno dibujado (Fig. 1A), y luego combina todos ellos como una imagen fusionada (Fig. 1B). Cortar imagen virtual utiliza una configuración de epifluorescencia es decir, filtros de campo amplio que permite a la cámara para captar todas las señales presentes en una cierta profundidad, incluidos los que no la perfección en el enfoque, por lo que el sector Virtual final es un sistema integrado de dos dimensiones de imagen que no es de un máximo proyección de la reconstrucción tridimensional de todo el páncreas. Tiempo medio de exploración Virtual Slice es de 30 minutos por muestra, pero puede tomar hasta una hora para una gran páncreas.
- Después de guardar la imagen, comienza su análisis mediante la apertura de la imagen con ImageJ. Cuando termine de cargar la imagen y aparece en la pantalla, abrir y ejecutar la macro rebanada análisis virtual ( un material complementario ).
- Siga las instrucciones paso a paso proporcionadas por el macro. Eliminar los efectos no deseados creado por la dispersión de luz con la "varita mágica" y herramientas "Seleccionar área". Comprobar y restar fondo innecesario de la imagen. Determinar el radio de la mayor islote con la herramienta "Línea" de modo que la función resultante de rodar la bola puede quitar con eficacia la luz de autofluorescencia y dispersas. Probar y seleccionar la más adecuada "umbral bajo" para capturar las señales fluorescentes de pequeños islotes y las agrupaciones de las células beta (<3x10 4 m 2). Probar y seleccionar la más adecuada "umbral alto" para capturar las señales fluorescentes de los islotes. Ejecutar la cuantificación de la rebanada virtual, que mediráy elaborar una lista de zona de los islotes, el perímetro, circularidad, y el diámetro de Feret.
Figura 1 A Cortar Virtual de análisis de imágenes de toda la distribución de las células beta en el páncreas adulto intacto
Imágenes de cada uno de los paneles ópticos de un páncreas de un ratón macho a 10 semanas adoptadas en virtud de un objetivo de 2x. Las imágenes incluyen la distribución de las islas, incluso pequeños grupos de células beta (<10 células).
Figura 1B Cortar Virtual de análisis de imágenes de toda la distribución de las células beta en el páncreas adulto intacto
Una rebanada unificada virtual con el páncreas dorsal a la derecha y el páncreas ventral de la izquierda. Barra de escala es de 5 mm.
Resultados representante
Preparación competentes del páncreas para obtener imágenes de rebanada virtual va a permitir una cuantificación efectiva de todas las buenas prácticas agrarias de etiquetado de las células beta en el páncreas entero como una rebanada de imagen virtual con islotes clara y distinta. Cortar imágenes éxito virtual de todo el páncreas in situ proporciona los medios para analizar y cuantificar las células beta, no sólo la zona de islotes individuales y totales, pero también distribución del tamaño de los islotes, el análisis regional, y los patrones de crecimiento también. Mientras que ImageJ mantiene la capacidad de detectar todas las células beta de forma simultánea en el análisis de imágenes Cortar Virtual, también puede controlar que las células beta de cuantificar por restringir el análisis a los tamaños de los islotes determinado (por área o diámetro), o por ubicación. Un análisis de norma excluye por ejemplo, los artefactos, los restos más pequeños que una sola de las células beta (<170 m 2) y registra el área, el perímetro (la distancia alrededor de un área), la circularidad (un grado de redondez, donde 1.0 representa un círculo perfecto), y el diámetro de Feret (la distancia más larga dentro de un área) de cada islote detectado. Cortar el análisis virtual es capaz de mejorar las imágenes virtuales corte mediante el empleo de la segmentación de cuencas, que distingue y separa los islotes se superponen en islotes individuales de acuerdo a sus formas. El análisis también produce una serie de imágenes detalladas, lo que incluye las máscaras de las imágenes en tanto baja y alta intensidad (Fig. 1C), un resumen de todas las islas supone, que son cada uno numerado individualmente y que figuran en la tabla de información correspondiente (Fig. . 1D), y la imagen original rebanada Virtual (Fig. 1B). Tenga en cuenta que el sesgo potencial técnico la hora de elegir los valores de umbral puede sesgar la cuantificación de los islotes de los alrededores, incluyendo la luz gratuita de grandes estructuras, o reduciendo el número total de los islotes, las señales débiles, especialmente a partir de pequeñas partículas.
Figura 1 C Cortar Virtual de análisis de imágenes de toda la distribución de las células beta en el páncreas adulto intacto
Una máscara de las partículas fluorescentes en la parte virtual. Códigos de colores: [1] azul: fluorescencia de baja intensidad, [2] verde: intensidad de fluorescencia intermedia, y [3] rojo: fluorescencia de alta intensidad.
Figura 1D análisis de la imagen virtual de pedacito de toda la distribución de las células beta en el páncreas adulto intacto
La cuantificación de los islotes individuales / grupos de células beta. Tenga en cuenta que cada uno de los islotes (incluyendo pequeños grupos de células beta) está numerado, con la información detallada en un gráfico correspondiente. Cuatro parámetros se tomaron para cada estructura: (1) área, (2) perímetro, (3) la circularidad: un grado de redondez en el número 1.0 representa un círculo perfecto, y (4) Feret de diámetro: la distancia más larga dentro de un área. Tenga en cuenta que # 706 muestra la resolución de los análisis con una superficie de sólo unas pocas células beta. Segmentación de las cuencas hidrográficas detecta grupos de islotes adyacentes, como la que se muestra, y apropiadamente los distingue como islotes distintos (islotes de 1554, 1555 y 1556).
Figura 1E Cortar Virtual de análisis de imágenes de toda la distribución de las células beta en el páncreas adulto intacto
3-dimensional terreno del análisis de corte virtual, con ejes de área, perímetro y el diámetro de Feret. Cada punto representa un islote.
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Discussion
El análisis de las imágenes rebanada virtual de los islotes y las agrupaciones de las células beta en el páncreas intacto proporciona una visión a gran escala de toda la distribución de los islotes. Evolución y los cambios en la distribución de los islotes total en el tiempo por lo tanto pueden ser estudiados y comparados. Un ejemplo se demuestra en el análisis de la formación de los islotes pancreáticos (1). Un análisis completo de páncreas ratones recién nacidos en distintos momentos (P1-P21) ha demostrado que los islotes están formados por fisión. Mientras que el beta-proliferación de las células se ajusta a una función de densidad de probabilidad lognormal en ratones a partir de P1-P10, P12 distribución de los islotes en adelante se desvía hacia la izquierda, lejos del modelo lognormal, lo que sugiere un proceso de fisión. Un análisis similar se realizó en el desarrollo de insulinoma progresiva en los ratones, que se ajustaban a una función logarítmica normal con los parámetros de posición del pico y la escala del eje X, y una distribución de ley potencial (2): 
P (x) = ax y. Los datos son efectivamente se presenta en gráficos de tres dimensiones del área, perímetro y el diámetro de Feret (Fig. 1E). Para nuestro estudio, los ratones transgénicos, en el que las células beta pancreáticas se marcaron genéticamente con la proteína verde fluorescente (GFP, 3, 4) bajo el control de la insulina de ratón que el promotor (MIP), se utilizaron. MIP-GFP también se puede cruzar con otros ratones transgénicos específicos en futuros estudios.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El estudio está respaldado por EE.UU. Servicio de Salud Pública de subvención DK-081527, 072473-DK y DK-20595 de la Universidad de Chicago Diabetes Research and Training Center (Animal principales modelos), y un regalo de la Fundación de la Familia Kovler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
