Summary
Följande protokoll beskriver processen att bukspottskörteln dissektion för virtuella skiva bildbehandling, och den efterföljande kvantifieringen av alla GFP taggade-beta-cellerna i hela bukspottkörteln.
Abstract
Spåra ändringar av specifika cellpopulationer i hälsa och sjukdom är ett viktigt mål för biomedicinsk forskning. Processen för att övervaka pankreas beta-celltillväxt och holme tillväxt är särskilt utmanande. Vi har utvecklat en metod för att fånga fördelningen av beta-celler i intakta bukspottkörteln hos transgena möss med fluorescens taggade-beta-celler med ett makro skriven för ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). Efter pankreas dissekering och vävnad clearing, är hela bukspottkörteln fångade som en virtuell skiva, varefter GFP-märkta beta-cellerna undersöks. I analysen ingår kvantifiering av totala beta-cell område, holme antal och storleksfördelning med hänvisning till specifika parametrar och platser för varje holme och för små kluster av beta-celler. Hela distributionen av holmar kan ritas i tre dimensioner, och information från distribution på storleken och formen på varje ö ger en kvantitativ och kvalitativ jämförelse av förändringarna i den totala beta-cell området med ett ögonkast.
Protocol
Del 1: Förberedelser av prover
- Placera en mus i en dissektion mikroskop, ta bort hela bukspottkörteln tillsammans med tolvfingertarmen och mjälten fortfarande ansluten och placera organ på en pre-vägd bild. Ta bort tolvfingertarmen genom att skära dess bindväv längs sidan där det binds till bukspottkörteln. Klipp ut och ta bort mjälten och överflödigt fett på bukspottkörteln tills bukspottkörteln är helt isolerad på bilden. (Bukspottskörteln fett är urskiljbara genom sin vita färg, som skiljer sig från de lite mörkare och Tanner färg i bukspottskörteln vävnad.)
- Sätt på ett täckglas (stor skyddsglas 50x75mm, standard skyddsglas 25x75mm) över bukspottkörteln så att den är helt täckt. Använd en vikt (t ex en tung bok) att platta bukspottkörteln mellan bild och lock. Beroende på vikt, plattas bukspottkörteln tar cirka fem minuter.
- Ta av vikt. Om bukspottkörteln är väl tillplattad mot bilden, placera den i 4% paraformaldehyd (PFA) vid 4 ° C över natten. På morgonen, ta bort täckglas och väl utsätta hela bukspottkörteln att PFA under dagen (6-8 timmar). Om bukspottkörteln inte är väl fast, låt den vara kvar i PFA längre, möjligen över natten. Överför bilderna till behållaren med 1% Triton X-100 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) över natten. Nästa dag, överföra bilderna till behållaren av mättat sackaros i 1-2 dagar. Sedan överföra bilderna i en behållare med 100% glycerol tills vävnaden rensas, vilket möjliggör optimal upplösning av fluorescerande signaler; vävnad clearing tar cirka 1-3 dagar. (Den fluorescerande signalerna kan kvarstå i veckor, till och med månader, men Undersökningen bör utföras snart efter vävnaden rensas för optimal upplösning.)
- Förvara bukspottkörteln i ett mörkt och svalt område för att bevara organ och dess fluorescerande signaler.
Del 2: Imaging och kvantifiera de beta-cell område i intakt bukspottkörteln
- Använd pincett eller handskar på händerna, ta glida ur behållaren med 100% glycerol. Förbered bilden för avbildning genom att torka bort överflödig glycerol och uteslutande rengöring på baksidan av omslaget glas med etanol.
- Öppna StereoInvestigator programvara (MicroBrightField, Williston, VT) och välj 2x objektiv för avbildning möss pancreata äldre än 3 veckor på stora glasskivor, eller 10x objektiv för avbildning möss pancreata yngre än 3 veckor pressas mellan två 25mm täckglas. Visualisera bilden genom att ställa in live-bild (Bild → Live Image). Välj en exponeringstid som tydligt visar den GFP-märkta beta-celler. (Underexponera bilden utesluter mindre holmar och beta-celler, medan overexposing bilden skapar ytterligare falska signaler.)
- Klicka var som helst på skärmen för att etablera en referenspunkt och fortsätta att rita en kontur runt hela bukspottkörteln. Starta Virtual Slice processen (Bild → Hämta Virtual Slice). Bestäm och välja den bästa fokalplanet dvs planet med det högsta antalet synliga och fokuserad holmar och beta-celler på Z-axeln genom att bläddra i fokus ratten. När valt fångar StereoInvestigator automatiskt den bild som visas på skärmen. Med motoriserade scenen, fångar Virtual Slice funktionen sekventiellt varje optisk panel som en distinkt bild i den ritade konturen (bild 1A) och sedan kombinerar alla dessa som en samman bilden (Fig. 1B). Virtuella Slice avbildning använder en epifluorescent konfiguration dvs widefield filter som gör att kameran kan fånga alla signaler närvarande vid ett visst djup, även de inte helt i fokus, så att det slutliga virtuella Slice är en integrerad tvådimensionell bild som inte är en maximal projektion av den tredimensionella rekonstruktionen av hela bukspottkörteln. Genomsnittlig Virtuella Slice skanning tid är 30 minuter per prov, men kan ta upp till en timme för en stor bukspottkörteln.
- När du har sparat bilden, börjar sin analys genom att öppna upp bilden med ImageJ. När bilden har lästs in och visas på skärmen, öppna och köra virtuella makro Slice analys ( Kompletterande material 1 ).
- Följ steg-för-steg-instruktioner som tillhandahålls av makro. Eliminera oönskade artefakter som skapas av ljusspridningen med "Magic Wand" och "Välj område" verktyg. Kontrollera och subtrahera onödiga bakgrund från bilden. Bestäm radien av den största holmen med "Line" verktyget så att den efterföljande Rulla boll Funktionen kan effektivt ta bort autofluorescens och spritt ljus. Testa och välja den mest lämpliga "låg tröskel" för att fånga fluorescerande signaler av små kobbar och kluster av beta-celler (<3x10 4 ìm 2). Testa och välja den mest lämpliga "hög tröskel" för att fånga fluorescerande signaler holmar. Kör kvantifiering av Virtual Slice, som ska mätaoch producera en lista över ö area, omkrets, cirkularitet och Féret diameter.
Figur 1A Virtuella Slice bildanalys av hela fördelningen av beta-celler i ett intakt vuxen bukspottkörtel
Bilder av enskilda optiska skivor av en manlig mus bukspottskörteln med 10-wk fattas enligt en 2x mål. Bilderna inkluderar hela distributionen av holmar, även små kluster av beta-celler (<10 celler).
Figur 1B Virtuella Slice bildanalys av hela fördelningen av beta-celler i ett intakt vuxen bukspottkörtel
En enhetlig virtuell skiva med rygg bukspottkörteln till höger och ventrala bukspottkörteln till vänster. Skala bar är 5 mm.
Representativa resultat
Proficient utarbetandet av en bukspottkörtel för Virtual Slice imaging kommer att möjliggöra en effektiv kvantifiering av alla GFP-märkta beta-celler i en hel bukspottkörteln som en virtuell Slice bild med klara och tydliga holmar. Lyckade Virtuella Skiva avbildning av hela bukspottkörteln på plats ger möjlighet att undersöka och kvantifiera de beta-cellerna, inte bara enskilda och total holme området, men också holme storleksfördelning, regional analys och mönster tillväxt också. Medan ImageJ upprätthåller förmågan att upptäcka alla beta-celler samtidigt i analysen av Virtual Slice bilder, det kan också styra vilka beta-cellerna att kvantifiera genom att begränsa analysen till vissa holme storlekar (per område eller diameter), eller efter plats. En vanlig analys utesluter artefakter t.ex. skräp mindre än en enda ß-cell (<170 ìm 2) och registrerar area, omkrets (avståndet omger ett område), rund (en viss rundhet, där 1,0 representerar en perfekt cirkel), och Féret diameter (det längsta avståndet inom ett område) för varje holme upptäckts. Virtual Slice analys kan förbättra virtuella skiva bilder genom att anställa Watershed segmentering, som skiljer och separerar överlappande islets i enskilda islets beroende på deras form. Analysen ger ytterligare en serie detaljerade bilder, detta inkluderar masker av bilderna under både låg och hög intensitet (figur 1C), en översikt av alla förmodade holmar, som är individuellt numrerade och som anges i en tabell med motsvarande information (Fig . 1D) och den ursprungliga virtuella Slice bilden (Fig. 1B). Observera att eventuella tekniska fördomar när man väljer tröskelvärden kan förvränga kvantifiering av holmarna genom att ta med omotiverade ljus omger stora strukturer, eller genom att minska det totala antalet holmar, särskilt svaga signaler från små partiklar.
Figur 1C Virtuella Slice bildanalys av hela fördelningen av beta-celler i ett intakt vuxen bukspottkörtel
En mask av det fluorescerande partiklar i den virtuella skiva. Färgkoder: [1] blå: låg intensitet fluorescens, [2] grön: mellanliggande intensitet fluorescens, och [3] rött: hög intensitet fluorescens.
Figur 1D Virtuella analys Skiva bild av hela fördelningen av beta-celler i ett intakt vuxen bukspottkörtel
Kvantifiering av enskilda kobbar / kluster av beta-celler. Observera att varje holme (inklusive små kluster av beta-celler) är numrerade, med information som anges i ett motsvarande diagram. Fyra parametrar togs för varje struktur: (1) område, (2) omkrets, (3) cirkularitet: en viss rundhet där antalet 1,0 representerar en perfekt cirkel, och (4) Féret diameter: det längsta avståndet inom ett område. Observera att # 706 visar analyserna upplösning med en yta på bara några få beta-celler. Watershed segmentering upptäcker grupper av närliggande holmar, såsom den som visas, och på lämpligt sätt skiljer dem som distinkt holmar (holmar 1554, 1555 och 1556).
Figur 1E Virtuella Slice bildanalys av hela fördelningen av beta-celler i ett intakt vuxen bukspottkörtel
3-dimensionell plot av den virtuella skiva analys, med axlar av area, omkrets och Féret diameter. Varje prick representerar en holme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen av Virtual Slice bilder av holmar och beta-cells kluster i intakt bukspottkörteln ger en storskalig bild av hela fördelningen av holmar. Utvecklingen och förändringarna i den totala holme över tiden kan alltså studeras och jämföras. Ett sådant exempel är visat i vår analys av bukspottkörtelns holmen bildning (1). En omfattande analys av neonatala möss pancreata vid olika tidpunkter (P1-P21) har visat att holmar bildas av fission. Medan beta-cellproliferation passar med en lognormala sannolikhet täthetsfunktionen hos möss från P1-P10, avviker holme distribution från P12 framåt åt vänster bort från lognormala mönster, vilket tyder på en process av fission. En liknande analys utfördes på progressiva insulinom utveckling hos möss, som passade en lognormala funktion med parametrarna i topp läge och x-axeln skala och en makt lag fördelning (2): 
P (x) = ax y. Uppgifterna effektivt presenteras i tredimensionella tomter i området, omkrets och Féret diameter (Fig. 1E). För vår studie, transgena möss, där pankreas beta-celler genetiskt märkta med grönt fluorescerande protein (GFP, 3, 4) under kontroll av musen insulin jag promotor (MIP), har använts. MIP-GFP kan också korsas med andra specifika transgena möss i framtida studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Studien stöds av US Public Health Service Grant DK-081.527, DK-072.473 och DK-20.595 till University of Chicago Diabetes Research and Training Center (djurmodeller Core), och en gåva från Kovler Family Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
