Summary
Следующий протокол описывает процесс поджелудочной рассечение для виртуальных изображений ломтик, и последующего количественного всех GFP-меткой бета-клеток в поджелудочной железе все.
Abstract
Отслеживание изменений конкретных популяций клеток в норме и патологии является важной целью проведения биомедицинских исследований. Процесс мониторинга панкреатических бета-клеток островков и рост особенно сложным. Мы разработали метод захвата распределения бета-клеток в поджелудочной железе нетронутыми трансгенных мышей с флуоресцентными метками бета-клеток с макроса, написанного для ImageJ (rsb.info.nih.gov / ц /). После вскрытия поджелудочной железы и ткани очистки, всей поджелудочной железы захватывается в качестве виртуального ломтик, после чего GFP-меткой бета-клеток рассматриваются. Анализ включает в себя количественную оценку суммарной бета-клеток площадь, количество островок и распределение по размерам со ссылкой на конкретные параметры и места для каждого островка и для небольших кластеров бета-клеток. Все распределение островков могут быть построены в трех измерениях, а также информации от распространения на размер и форму каждого островка позволяет количественное и качественное сравнение изменений в общей бета-клеток области с первого взгляда.
Protocol
Часть 1: Подготовка образцов
- Место мыши под микроскопом рассечение, удаление всей поджелудочной железы вместе с двенадцатиперстной кишки и селезенки еще привязаны, и место органов на предварительно взвешенные стекло. Удалить двенадцатиперстной кишки за счет сокращения ее соединительной ткани вдоль той стороны, где она привязана к поджелудочной железе. Вырезать и удалить селезенку и лишнего жира на поджелудочную железу, пока поджелудочная железа полностью изолирован на слайде. (Поджелудочной жир выделялся своей белого цвета, которые отличаются от слегка темнее и цвета загара ткани поджелудочной железы.)
- Место покровное (большой стеклянной крышкой 50x75mm, стандартная крышка стекла 25x75mm) на поджелудочную железу так, чтобы она полностью покрыта. Использование веса (например, тяжелую книгу), чтобы сгладить поджелудочной железы между слайдов и ее обложке. В зависимости от веса, уплощение поджелудочной железы занимает около пяти минут.
- Сними веса. Если поджелудочная железа хорошо прижался слайдов, поместите его в 4% параформальдегида (PFA) при 4 ° С в течение ночи. Утром, удалите покровные и хорошо подвергать все поджелудочной железы PFA в течение дня (6-8 часов). Если поджелудочная железа не очень хорошо фиксирована, позволяют ему оставаться в PFA больше, возможно, в одночасье. Передача слайды в контейнере с 1% Тритон Х-100 в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение ночи. На следующий день, передача слайды в контейнере насыщенных сахарозы в течение 1-2 дней. Затем перенесите слайды в контейнере 100% глицерина, пока ткань не установлен, что позволяет оптимальное разрешение флуоресцентных сигналов; ткани очистки занимает примерно 1-3 дня. (Флуоресцентные сигналы могут сохраняться в течение недель и даже месяцев, но изображение должно быть выполнено сразу после ткань очищается для оптимального разрешения.)
- Магазин поджелудочной железы в темном и прохладном месте, чтобы сохранить орган и его флуоресцентные сигналы.
Часть 2: Работа с изображениями и количественного бета-клеток в области нетронутыми поджелудочной железы
- Использование щипцов или руками в перчатках, возьмите слайд из контейнера со 100% глицерина. Подготовка слайдов для работы с изображениями, протирая лишнюю глицерина и исключительно очистки задней крышкой стекла с этанолом.
- Открытое StereoInvestigator программное обеспечение (MicroBrightField, Williston, VT) и выберите 2x объектив для мышей изображений pancreata старше 3-х недель на большие стеклянные пластинки или 10x объектив для мышей изображений pancreata моложе 3-х недель нажата между двумя 25-мм покровные. Визуализируйте изображение, установив его на живое изображение (Image → живого изображения). Выберите время экспозиции, что ясно показывает, GFP-меткой бета-клеток. (Underexposing изображения исключает меньших островков и бета-клеток, в то время передержки изображения создает дополнительные ложные сигналы.)
- Щелкните в любом месте на экране, чтобы установить точку отсчета и приступим к подготовке контур вокруг всей поджелудочной железы. Инициировать процесс Виртуальное фрагмент (Image → приобретать виртуальные Slice). Определить и выбрать лучший координационного т.е. плоскости, плоскости с наибольшим количеством видимых и целенаправленных островков и бета-клеток на Z-оси, прокручивая в центре ручки. Как только выбрали, StereoInvestigator автоматически захватывает изображение, отображаемое на экране. С моторизованных этапе виртуальным фрагмент последовательно захватывает каждого оптического панели, как различные изображения в пределах обращается контура (рис. 1А), а затем объединяет их всех как одного объединенного изображения (рис. 1В). Виртуальное изображение фрагмента использует epifluorescent конфигурации, т. е. широкопольных фильтров, позволяет камере захватить все сигналы, присутствующие на определенной глубине, в том числе и не совсем в фокусе, так что конечный Виртуальный фрагмента интегрированной двухмерное изображение, которое не является максимальной проекция из трехмерной реконструкции всей поджелудочной железы. Средняя Виртуальный время проверки фрагмента 30 мин на один образец, но может занять до часа для больших поджелудочной железы.
- После сохранения изображения, начинают свой анализ, открыв изображение с ImageJ. При завершении загрузки изображений и появляется на экране, открыть и запустить виртуальные Макрос анализа фрагментов ( Дополнительный материал 1 ).
- Следуйте шаг за шагом инструкциям макроса. Ликвидация нежелательных артефактов, созданных с рассеянием света "Волшебная палочка" и "Выбрать Регион" инструменты. Проверьте и вычесть ненужные фон от изображения. Определить радиус наибольшего островок с "Линия" инструментом, так что последующие Роллинг особенность бала может эффективно удалить аутофлюоресценция и рассеянного света. Тестирование и выбрать наиболее подходящий "Низкий порог" для захвата флуоресцентные сигналы от небольших островков и скопления бета-клеток (<3x10 4 мкм 2). Тестирование и выбрать наиболее подходящий "высокий порог" для захвата флуоресцентные сигналы островков. Выполнить количественную оценку Виртуальный фрагмент, который будет измерятьи составить список островок площадь, периметр, округлости и диаметра Фере в.
Рисунок 1А виртуальных фрагментов изображения анализа весь дистрибутив бета-клеток в поджелудочной железе нетронутыми взрослых
Изображения отдельных оптических панелей мужской поджелудочной железы мыши в 10-недельного взят под 2x цели. Изображения включают все распределение островков, даже небольшие скопления бета-клеток (<10 клеток).
Рис 1B Виртуальный анализа изображений Кусочек весь дистрибутив бета-клеток в поджелудочной железе нетронутыми взрослых
Единого виртуального срез с дорсальной поджелудочной железы на правой и вентральной поджелудочной железы слева. Шкала бар 5 мм.
Представитель Результаты
Опытный подготовки поджелудочной железы для виртуальных изображений фрагментов позволит эффективной количественной оценки всех GFP-меткой бета-клеток в поджелудочной железе всего в качестве виртуального изображения фрагментов с ясным и отчетливым островков. Успешное Виртуальный изображений Кусочек целом поджелудочной железы на месте предоставляет средства для изучения и количественной оценки бета-клеток, а не только индивидуальной и общей островок области, но и островок размер дистрибутива, региональный анализ, и рост клеток, а также. Хотя ImageJ поддерживает возможности для выявления всех бета-клеток одновременно в анализе виртуальной изображения фрагмент, он также может контролировать, какие бета-клеток количественно, ограничиваясь анализом определенных размеров островка (по площади или диаметр), или по месту расположения. Стандартный анализ исключает артефакты, например, мусора меньше, чем одна бета-клеток (<170 мкм 2) и регистрирует площадь, периметр (расстояние окружающих область), округлости (степень округлости, где 1,0 представляет собой идеальный круг), и диаметр Фере (в длинную дистанцию в пределах области) за каждый островок обнаружено. Виртуальный анализ фрагмента, способные повышать виртуальных образов, используя часть водораздела сегментации, которая отличает и отделяет перекрытия островков на отдельные островки в зависимости от их формы. Анализ дальнейшего производит ряд детальных изображений; это включает в себя маски изображения под низкой и высокой интенсивности (рис. 1в), краткое содержание всех предполагаемых островков, каждый из которых индивидуально пронумерованы и перечислены в таблице соответствующей информации (рис. . 1D), а также оригинальные виртуальные изображения фрагментов (рис. 1В). Обратите внимание, что потенциальные технические предвзятость при выборе пороговых значений может исказить количественного островков, включив свет, окружающий безвозмездной крупные структуры, либо за счет снижения общего количества островков, особенно слабые сигналы от мелких частиц.
Рис 1С виртуальных фрагментов изображения анализа весь дистрибутив бета-клеток в поджелудочной железе нетронутыми взрослых
Маска флуоресцентные частицы в виртуальном срез. Цвет коды: [1] синий: низкая интенсивность флуоресценции; [2] Зеленый: промежуточные интенсивности флуоресценции, а также [3] красным: высокая интенсивность флуоресценции.
Рис. 1D Виртуальный анализа изображений Кусочек весь дистрибутив бета-клеток в поджелудочной железе нетронутыми взрослых
Количественная оценка отдельных островков / кластеров бета-клеток. Заметим, что каждый островок (в том числе малых кластеров бета-клеток) имеет номер, с его информации подробно описаны в соответствующей диаграмме. Четыре параметры были взяты для каждой структуры: (1) области; (2) периметр, (3) округлости: степень округлости, где число 1.0 представляет идеальный круг, и (4) диаметр Фере это: длинное расстояние в пределах области. Обратите внимание, что # 706 показывает анализ разрешение с площадью всего несколько бета-клеток. Водораздел сегментации определяет группы прилегающие к нему острова, такие, как показано, и соответствующим образом отличает их в качестве отдельных островков (островков 1554, 1555 и 1556).
Рис 1E виртуальных фрагментов изображения анализа весь дистрибутив бета-клеток в поджелудочной железе нетронутыми взрослых
3-мерный участок виртуального анализа ломтик, с осями площадь, периметр и диаметр Фере в. Каждая точка представляет собой небольшой островок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ виртуальных образов Кусочек островков и бета-клеток кластеров в неповрежденную поджелудочной железы обеспечивает крупномасштабных вид на весь распределения островков. События и изменения в общем распределении островок в течение долгого времени, таким образом, изучать и сравнивать. Такой пример показал в нашем анализе островков поджелудочной железы образование (1). Всесторонний анализ неонатальной pancreata мышей в различные моменты времени (P1-P21) показал, что островки формируются деления. Хотя бета-клеток согласуется с логнормальное функция плотности вероятности у мышей из P1-P10, островок распределения от P12 вперед отклоняется влево от логнормальное картины, предполагая, процесс деления. Аналогичный анализ был проведен на прогрессивное развитие инсулиномы у мышей, которые установлены логнормальное функции с параметрами пика позицию и ось х масштаба и распределения степенной закон (2): 
Р (х) у = ах. Данные эффективно представлены в трехмерной графики площадь, периметр и диаметр Фере (рис. 1E). Для нашего исследования, у трансгенных мышей, в которых панкреатические бета-клетки были генетически с меткой зеленый флуоресцентный белок (GFP, 3, 4) под контролем мыши инсулина Я промоутер (MIP), были использованы. MIP-GFP может быть скрещены с другими конкретными трансгенных мышей, в будущих исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке США Служба общественного здравоохранения Грант DK-081 527, DK-072 473 и DK-20595 в Чикагском университете диабета Научно-учебный центр (Core животных моделях), а также подарок от Фонда семьи Ковлер.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
