Summary
Het volgende protocol schetst het proces van het pancreas dissectie voor virtuele slice beeldvorming, en de daaropvolgende kwantificering van alle GFP-gelabelde beta-cellen in de gehele alvleesklier.
Abstract
Traceren veranderingen van specifieke cel populaties in gezondheid en ziekte is een belangrijk doel van het biomedisch onderzoek. Het proces van de controle pancreatische beta-cel-proliferatie en eilandje groei vormt een bijzondere uitdaging. We hebben een methode ontwikkeld om de distributie van beta-cellen vast te leggen in het intacte pancreas van transgene muizen met fluorescentie-gelabeld beta-cellen met een macro geschreven voor ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). Na de pancreas dissectie en weefsel clearing wordt de hele alvleesklier vastgelegd als een virtuele slice, waarna de GFP-gelabelde beta-cellen worden onderzocht. De analyse omvat de kwantificering van de totale bèta-cel gebied, eilandje aantal en de grootte distributie met verwijzing naar specifieke parameters en locaties voor elk eilandje en voor kleine clusters van beta-cellen. De gehele verdeling van de eilandjes kunnen worden uitgezet in drie dimensies, en de informatie van de distributie op de grootte en vorm van elk eilandje staat een kwantitatieve en kwalitatieve vergelijking van de veranderingen in de totale beta-cel gebied in een oogopslag.
Protocol
Deel 1: Voorbereiding van Monsters
- Plaats een muis onder een dissectie microscoop, verwijder dan de hele alvleesklier, samen met de twaalfvingerige darm en de milt nog steeds verbonden, en plaats de organen op een vooraf gewogen glasplaatje. Verwijder de twaalfvingerige darm door te snijden zijn bindweefsel langs de kant waar het wordt gebonden aan de alvleesklier. Knippen en verwijder de milt en overtollige vet op de alvleesklier tot de alvleesklier is volledig geïsoleerd op de dia. (Pancreas vet is te onderscheiden door de witte kleur, als onderscheiden van de iets donkerder en leerlooier kleur van de pancreas weefsel.)
- Plaats een dekglaasje (grote dekglas 50x75mm; standaard dekking glas 25x75mm) over de alvleesklier, zodat het helemaal bedekt is. Gebruik een gewicht (bijvoorbeeld een zwaar boek), aan de alvleesklier tussen de glijbaan en het deksel plat. Afhankelijk van het gewicht, afvlakking van de alvleesklier duurt ongeveer vijf minuten.
- Verwijder het gewicht. Als de pancreas is goed plat tegen de glijbaan, plaatst u deze in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C gedurende de nacht. In de ochtend, verwijder de dekglaasjes en goed de hele alvleesklier bloot te stellen aan PFA gedurende de dag (6-8 uur). Als de alvleesklier niet goed vast, laat het blijven in de PFA langer, mogelijk 's nachts. Breng de dia's om de container met 1% Triton x-100 in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 's nachts. De volgende dag, overdracht van de dia's naar de container van verzadigde sucrose voor 1-2 dagen. Dan overdracht van de dia's aan een container van 100% glycerol totdat het weefsel is verwijderd, die het mogelijk maakt voor de optimale resolutie van TL-signalen; weefsel clearing duurt ongeveer 1-3 dagen. (De fluorescerende signalen kunnen aanhouden weken en zelfs maanden, maar beeldvorming moet snel worden uitgevoerd na het weefsel is vrijgemaakt voor een optimale resolutie.)
- Bewaar de alvleesklier in een donkere en koele plaats met het oog op het orgel en de fluorescerende signalen te behouden.
Deel 2: Imaging en kwantificeren van de beta-cel gebied in de intacte alvleesklier
- Met behulp van een tang of een gehandschoende handen, neemt u de schuif uit de container met 100% glycerol. Bereiden op de foto voor de beeldvorming door afvegen teveel glycerol en uitsluitend het schoonmaken van de achterkant van het deksel glas met ethanol.
- Open de StereoInvestigator software (MicroBrightField, Williston, VT) en selecteer de 2x objectief voor imaging muizen pancreata ouder dan 3 weken op grote glazen dia's, of het 10x objectief voor imaging muizen pancreata die jonger zijn dan drie weken geperst tussen twee 25mm dekglaasjes. Visualiseer het beeld om door het leven om de afbeelding (Image → Live Image). Selecteer een belichtingstijd die duidelijk toont het GFP-gelabelde beta-cellen. (Onderbelicht het beeld sluit kleinere eilandjes en de beta-cellen, terwijl het beeld overbelichten zorgt voor extra valse signalen.)
- Klik ergens op het scherm om een referentiepunt te richten en een contour rond de hele alvleesklier te tekenen door te gaan. Start het Virtual Slice proces (Afbeelding → Acquire Virtual Slice). Bepalen en kies de beste focal plane dat wil zeggen, het vliegtuig met het hoogste aantal zichtbare en gerichte eilandjes en beta-cellen op de Z-as door te bladeren de focus knop. Eenmaal gekozen, StereoInvestigator legt automatisch het beeld op het scherm. Met de gemotoriseerde fase, de Virtual Slice-functie legt opeenvolgend elk optisch paneel als een aparte beeld binnen de getrokken contour (Fig. 1A) en combineert alle van ze als een samengevoegde afbeelding (Fig. 1B). Virtual Slice beeldvorming maakt gebruik van een epifluorescerende configuratie wil zeggen, groothoek filters die het mogelijk maakt de camera vast te leggen alle signalen aanwezig zijn op een bepaalde diepte, ook als die niet perfect in focus, zodat het uiteindelijke Virtual Slice is een geïntegreerde tweedimensionale afbeelding die niet is een maximum projectie van de drie-dimensionale reconstructie van de gehele alvleesklier. Gemiddelde Virtual Slice scantijd is 30 minuten per sample, maar kan tot een uur voor een grote alvleesklier.
- Na het opslaan van het beeld, beginnen de analyse van de openstelling van het beeld met ImageJ. Als de afbeelding laden afwerking en verschijnt op het scherm, open en lopen de Virtual Slice analyse macro ( Aanvullend materiaal een ).
- Volg de stap-voor-stap instructies die door de macro. Elimineer ongewenste artefacten gecreëerd door lichtverstrooiing met de "Magic Wand 'en' Select Area" tools. Controleer en aftrekken onnodige achtergrond van de afbeelding. Bepaal de straal van de grootste eilandje met de "Line" tool, zodat de daaruit voortvloeiende Rolling Ball functie kan effectief te verwijderen autofluorescentie en verstrooid licht. Testen en selecteren de meest geschikte "lage drempel" om de fluorescerende signalen van kleine eilandjes en clusters van beta-cellen vast te leggen (<3x10 4 um 2). Testen en selecteren de meest geschikte "hoge drempel" om de fluorescerende signalen van eilandjes vast te leggen. Voer de kwantificering van de Virtual Slice, die metenen produceren een lijst van eilandje oppervlakte, omtrek, circulariteit en Feret de diameter.
Figuur 1A Virtual Slice beeldanalyse van de volledige distributie van de beta-cellen in een intacte volwassen pancreas
Beelden van afzonderlijke optische panelen van een mannelijke muizen alvleesklier op 10-wk genomen uit hoofde van een 2x doelstelling. De beelden zijn van de volledige distributie van de eilandjes, zelfs kleine clusters van beta-cellen (<10 cellen).
Figuur 1B Virtual Slice beeldanalyse van de volledige distributie van de beta-cellen in een intacte volwassen pancreas
Een geïntegreerde virtuele slice met de dorsale alvleesklier aan de rechterkant en de ventrale alvleesklier aan de linkerkant. Schaal bar is 5 mm.
Representatieve resultaten
Vakkundig de voorbereiding van een pancreas voor de Virtual Slice imaging zal zorgen voor een effectieve kwantificering van alle GFP-gelabelde beta-cellen in een hele alvleesklier als een Virtual Slice beeld met helder en duidelijk eilandjes. Succesvolle Virtual Snijd beeldvorming van de gehele alvleesklier in situ biedt de middelen om te onderzoeken en te kwantificeren van de beta-cellen, niet alleen de individuele en de totale oppervlakte eilandje, maar ook eilandje grootteverdeling, regionale analyses, en groeipatronen ook. Terwijl ImageJ handhaaft de capaciteit om gelijktijdig detecteren alle beta-cellen in de analyse van de Virtual Slice beelden, maar kan ook bepalen welke bèta-cellen te kwantificeren door het beperken van de analyse tot bepaalde eilandje maten (per gebied of diameter), of per locatie. Een standaard analyse sluit artefacten zoals puin kleiner is dan een enkele beta-cel (<170 um 2) en registreert de oppervlakte, omtrek (de afstand rond een gebied), rondheid (een zekere mate van rondheid, waarbij 1,0 staat voor een perfecte cirkel), Feret en de diameter van (de langste afstand binnen een gebied) voor elk eilandje ontdekt. Virtual Slice analyse is in staat het verbeteren virtuele slice afbeeldingen door het gebruik van Watershed segmentatie, wat onderscheidt en scheidt overlappende eilandjes in afzonderlijke eilandjes op basis van hun vormen. De analyse levert verder een reeks gedetailleerde beelden, dit omvat maskers van de beelden onder zowel lage als hoge intensiteit (Fig. 1C), een overzicht van alle veronderstelde eilandjes, die elk individueel genummerd en vermeld in een tabel met bijbehorende informatie (Fig . 1D), en de oorspronkelijke Virtual Slice afbeelding (Fig. 1B). Merk op dat eventuele technische vooringenomenheid bij de keuze van drempelwaarden kan tot gevolg hebben de kwantificering van de eilandjes door het opnemen van gratis licht omliggende grote structuren, of door vermindering van het aantal kleine eilandjes, in het bijzonder zwakke signalen uit kleine deeltjes.
Figuur 1C Virtual Slice beeldanalyse van de volledige distributie van de beta-cellen in een intacte volwassene pancreas
Een masker van de fluorescerende deeltjes in de virtuele slice. Kleurcodes: [1] blauw: lage intensiteit fluorescentie; [2] groen: intermediate intensiteit fluorescentie, en [3] rood: een hoge intensiteit fluorescentie.
Figuur 1D Virtual Slice beeldanalyse van de volledige distributie van de beta-cellen in een intacte volwassen pancreas
Kwantificering van de afzonderlijke eilandjes / clusters van de beta-cellen. Merk op dat elk eilandje (met inbegrip van kleine clusters van beta-cellen) is genummerd, met de informatie zoals gespecificeerd in een bijbehorende grafiek. Vier parameters werden genomen voor elke structuur: (1) gebied, (2) perimeter, (3) circulariteit: een zekere mate van rondheid, waar het nummer 1.0 staat voor een perfecte cirkel, en (4) Feret de diameter van: de langste afstand binnen een gebied. Merk op dat # 706 de analyses resolutie schermen met een oppervlakte van slechts een paar beta-cellen. Watershed segmentatie detecteert groepen van naburige eilandjes, zoals aangegeven de ene, en op passende wijze onderscheidt hen als afzonderlijke eilandjes (eilandjes 1554, 1555 en 1556).
Figuur 1E Virtual Slice beeldanalyse van de volledige distributie van de beta-cellen in een intacte volwassen pancreas
3-dimensionale plot van de virtuele slice-analyse, waarbij de assen van oppervlakte, omtrek en de diameter van Feret. Elke stip staat voor een eilandje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De analyse van Virtual Slice beelden van eilandjes en beta-cel clusters in de intacte alvleesklier zorgt voor een grote weergave van de gehele verdeling van de eilandjes. Ontwikkelingen en veranderingen in het totaal eilandje verdeling over de tijd kan dus worden bestudeerd en vergeleken. Zo'n voorbeeld wordt gedemonstreerd in onze analyse van de eilandjes van Langerhans formatie (1). Een uitgebreide analyse van neonatale muizen pancreata op verschillende tijdstippen (P1-P21) heeft aangetoond dat eilandjes worden gevormd door splijting. Terwijl de beta-cel proliferatie past bij een lognormale kansdichtheidsfunctie bij muizen van P1-P10, eilandje distributie van P12 verder afwijkt naar links weg van de lognormale patroon, hetgeen duidt op een proces van splitsing. Een soortgelijke analyse werd uitgevoerd op progressieve insulinoom ontwikkeling in muizen, die een lognormale functie met de parameters van piek positie en de x-as schaal gemonteerd, en een vermogen wet distributie (2): 
P (x) = ax y. De gegevens worden effectief in drie-dimensionale plots van de oppervlakte, omtrek en de diameter van Feret (fig. 1E). Voor onze studie, transgene muizen, waarin de pancreatische beta-cellen genetisch waren met groen fluorescerend eiwit (GFP, 3, 4) gelabeld onder de controle van de muis insuline I promoter (MIP), werden gebruikt. MIP-GFP kan ook worden gekruist met andere specifieke transgene muizen in toekomstige studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De studie wordt ondersteund door US Public Health Service Grant DK-081527, DK-072473 en DK-20595 aan de Universiteit van Chicago Diabetes Research and Training Center (Animal Models Core), en een geschenk van de Kovler Family Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
