Summary
以下のプロトコールは、膵臓の仮想スライスイメージングのための解剖、および全体の膵臓内のすべてのGFPタグ付きβ-細胞のその後の定量化のプロセスを概説します。
Abstract
健康と病気の特定の細胞集団の変化をトレースすると生物医学研究の重要な目標です。モニタリングの膵臓β細胞の増殖および膵島の成長のプロセスは特に困難である。我々はImageJ（rsb.info.nih.gov / IJ /）用に書かれたマクロを使用して蛍光タグ付きのβ-細胞とトランスジェニックマウスの無傷の膵臓のβ細胞の分布をキャプチャする方法を開発した。膵臓の解剖と組織の清算に続いて、全体の膵臓は、その後GFP -タグ付きβ-細胞が検討されている、仮想スライスとしてキャプチャされます。分析は、各島のためとβ-細胞の小さなクラスターのための特定のパラメータとの位置への参照を使用して、全β-細胞の面積、膵島の数とサイズ分布の定量化が含まれています。島の全体的な分布は、3次元にプロットし、各島のサイズと形状分布からの情報が一目で全体的なβ細胞面積の変化の定量的および定性的な比較を可能にすることができます。
Protocol
第1部：試験片の調製
- 解剖顕微鏡下でマウスを置く、まだ接続されている十二指腸と脾臓と一緒に全体の膵臓を削除して、事前に計量したガラススライド上に臓器を置きます。それは膵臓にバインドされている側に沿って結合組織を切断して十二指腸を削除します。膵臓が完全にスライドで隔離されるまで、膵臓で脾臓や余分な脂肪をカットして取り外します。 （膵組織の少し暗いとタナー色から分化したと膵脂肪は、その白い色で区別できる。）
- それが完全に覆われるように膵臓上、カバースリップを（標準のカバーガラス25x75mm 50x75mm大型カバーガラス）に置きます。スライドとカバーの間に膵臓を平坦にする（重い本など）の重量を使用してください。重量に応じて、膵臓を平坦化すること約5分かかります。
- 重量をはずしなさい。膵臓は、スライドに対しても平坦化の場合は、4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド（PFA）に置きます。午前中は、カバーガラスを取り除き、よく日中のPFAに膵臓全体を（6-8時間）に公開。膵臓が十分に固定されていない場合、それは、長いPFAでおそらく一晩おくことができます。一晩（PBS）リン酸緩衝生理食塩水にトリトンX - 100 1％でコンテナにスライドを移し。翌日、1〜2日のために飽和ショ糖の容器にスライドを転送する。その後、蛍光シグナルの最適な解像度を可能にする組織がクリアされるまで100％のグリセロールの容器、にスライドを移転すること、組織の清算は、約1-3日かかります。 （蛍光シグナルは、数週間、および月間持続することがありますが、組織が最適な解決のためにクリアされた後の画像をすぐに実行する必要があります。）
- オルガンとその蛍光シグナルを維持するために暗く、涼しい場所で膵臓を保管してください。
第2部：画像及び無傷の膵臓のβ細胞の面積を定量化
- ピンセットや手袋をはめた手を使って、100％のグリセロールとコンテナのスライドを取り出します。過剰なグリセロールを拭き取り、排他的にエタノールでカバーガラスの背面をクリーニングによりイメージングのためのスライドを準備します。
- StereoInvestigatorソフトウェア（MicroBrightField、ウィリストン、バーモント州）を開き、3つの大きなガラスのスライド上で数週間、または2つの25ミリメートルカバーガラスの間に押された3週間より膵臓若いイメージングマウスの10倍の対物レンズより膵臓古いイメージングマウスの2倍の対物レンズを選択します。画像（イメージ→ライブイメージを）生きるためにそれを設定して、イメージを視覚化する。明らかにGFP -タグ付きβ-細胞を示して露光時間を選択してください。 （画像をoverexposingには、追加の偽信号を作成しながら画像をUnderexposingと、小さな島とβ-細胞を除きます。）
- 基準点を確立するために画面上の任意の場所をクリックし、全体の膵臓の周りに輪郭を描画するために進んでください。仮想スライスのプロセス（画像→仮想スライスを取得）を開始します。最高の焦点面、すなわち、フォーカスノブをスクロールしてZ軸上で可視的を絞った島とβ-細胞の数が最も多い平面を決定し、選択します。選択後は、StereoInvestigatorは自動的に画面に表示された画像をキャプチャします。電動ステージで、仮想スライス機能は、連続して描かれた輪郭（図1A）内に個別のイメージとしてそれぞれの光学パネルをキャプチャして、1つのマージされた画像（図1B）として、それらのすべてを兼ね備えています。仮想スライスイメージングは、落射蛍光コンフィギュレーションを使用して、最終的なバーチャルスライスが最大ではない統合された二次元画像になるようにカメラがない完璧にピントのものも含めて一定の深さに存在するすべての信号を、キャプチャすることができますすなわち、広視野フィルタ膵臓全体の三次元再構成からの投影。平均的な仮想スライスのスキャン時間は、サンプルあたり30分ですが、大規模な膵臓のために時間かかることがあります。
- 画像を保存した後、ImageJを使用してイメージを開放することで、その分析を開始。画像のロードが完了し、画面に表示されたら、仮想スライス分析マクロを（開いて実行補足資料1 ）。
- マクロで提供されるステップバイステップの指示に従ってください。 "魔法の杖"と"範囲選択"ツールを使用して光散乱によって作成された不要なアーチファクトを除去する。画像から不要な背景を確認し、引く。その後のローリングボールの機能が効果的に自家蛍光や散乱光を除去できるように、"ライン"ツールとの最大の膵島の半径を決定する。 β-細胞の小さな島とクラスターの蛍光シグナルを捕捉するために最も適切な"低しきい値"をテストし、選択（<3 × 10 4μmの2）。膵島の蛍光シグナルを捕捉するために最も適切な"最大しきい値"をテストし、選択してください。測定される仮想スライス、の定量化を実行します。と膵島面積、周囲、真円度、およびフェレーの直径のリストを生成します。
そのまま成人の膵臓のβ細胞の全体的な分布の図1A仮想スライスの画像解析
10週の雄マウスの膵臓の個々の光学パネルの画像は、2倍の目標の下で撮影。イメージがさらに膵島、β細胞の小さなクラスター（<10細胞）のディストリビューション全体が含まれています。
そのまま成人の膵臓のβ細胞の全体的な分布の図1B仮想スライスの画像解析
右側の背側膵と左の腹側膵と統合された仮想スライス。スケールバーは5 mmである。
代表的な結果
バーチャルスライスイメージングのための膵臓の熟練準備ははっきりと異なる島で仮想スライス画像全体膵臓内のすべてのGFPタグ付きβ-細胞の効果的な定量化が可能になります。 その場で膵臓全体の成功バーチャルスライス画像も同様にβ-細胞のみならず、個々と全体の膵島面積だけでなく、膵島のサイズ分布、地域分析、および成長パターンを調べ、定量化する手段を提供します。 ImageJは仮想スライス画像の分析で同時にすべてのβ-細胞を検出する能力を維持しながら、それはまた、特定の膵島のサイズ（面積または直径によって）に分析を制限することによって、または場所によって定量化するためのβ-細胞を制御することができます。標準分析では、アーティファクトの例、単一のβ-細胞（<170μmの2）と、レコード領域、周囲（地域を取り巻く距離）、循環（1.0は完全な円を表す真円度、）よりも小さい破片を、除外と各島のためのフェレーの直径（エリア内の最も長い距離）が検出されました。仮想スライス分析は、その形状に応じて個々の小島に重なって島を区別し、分離流域セグメンテーションを採用することで、仮想スライス画像を向上させることが可能です。分析は、さらに詳細な一連のイメージを生成しますが、これはそれぞれ個別の番号と対応する情報（図中の表に記載されている低域と高強度（図1C）の両方の下の画像のマスク、すべての推定膵島の輪郭を、含まれています。1D）、そしてオリジナルの仮想スライス画像（図1B）。しきい値を選択する潜在的な技術的なバイアスが大規模な構造を囲む余計な光を含むことにより、または特に小島、小さな粒子からの微弱な信号の総数を減らすことによって、島のスキュー定量化できることに注意してください。
そのまま成人の膵臓のβ細胞の全体的な分布の図1C仮想スライスの画像解析
仮想スライスの蛍光粒子のマスク。カラーコード：[1]青：低強度の蛍光、[2]緑：中間強度の蛍光、及び[3]赤：高輝度の蛍光。
そのまま成人の膵臓のβ細胞の全体的な分布の1次元仮想スライスの画像解析を図
個々の島/β-細胞のクラスターの定量化。各島が（β-細胞の小さなクラスターを含む）対応するグラフで説明するその情報を、番号付けされていることに注意してください。 （3）真円度、（2）境界、（1）面積：：4つのパラメータは、それぞれの構造のために採取した数1.0は完全な円を表す丸みの程度、（4）フェレーの直径：エリア内で最長の距離。 ＃706はわずか数β-細胞の面積と分析結果の解像度を表示することに注意してください。流域セグメンテーションなど示されているものとして、隣接する島のグループを検出し、適切に明確な小島（小島1554、1555、および1556）として、それらを区別します。
そのまま成人の膵臓のβ細胞の全体的な分布の図1E仮想スライスの画像解析
面積、境界、およびフェレーの直径の軸を持つ仮想スライスの解析の3次元プロット、。各ドットは、膵島を表します。
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Discussion
無傷の膵臓のランゲルハンス島とβ細胞のクラスターの仮想スライス画像の解析は、島の全体の分布の大規模なビューを提供します。発展と時間をかけて合計膵島の分布の変化は、このように研究し、比較することができます。そのような例は、膵島の形成の分析（1）で示されています。様々な時点（P1 - P21）での新生児マウスの膵臓の包括的な分析は、島が分裂によって形成されることが実証されています。 β-細胞の増殖は、P12以降P1 - P10、膵島の分布から、マウスで対数正規確率密度関数でフィットしながら核分裂の過程を示唆し、対数正規分布のパターンから離れて左方向にずれる。同様の分析は、進行性のピーク位置とx軸のスケールのパラメータを持つ対数正規関数を装着したマウスのインスリノーマの開発、およびべき乗分布（2）上で行った。 
P（x）は=斧yを 。データを効果的に面積、周囲とフェレーの直径（図1E）の3次元プロットで表示されます。膵β細胞が遺伝的に緑色蛍光タンパク質（GFP、3、4）でタグ付けされた私たちの研究、トランスジェニックマウス、のためにマウスのインスリンIプロモーター（MIP）の制御下で、使用されていました。 MIP - GFPはまた、今後の研究の他の特定のトランスジェニックマウスと交配することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
研究は、シカゴの糖尿病研究研修センター（動物モデルコア）、およびKovlerファミリー財団からの贈り物の大学に米国公衆衛生サービスグラントDK - 081527、DK - 072473とDK - 20595によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
