3D Культура Подвал Мембрана Анализ: Культивирование раковых клеток на 3D Подвал Мембрана Белковая матрица для изучения вторжения клеток

Overview

Это видео предоставляет подробную методологию для выращивания раковых клеток молочной железы в 3D мембранной мембранной белковой матрице, окстифицируя потенциал 3D-культуры в оценке вторжения клеток в окружающую среду.

Protocol

1. Трехмерная культура раковых клеток молочной железы в матрице мембран подвала (Техника встраивания)

1. Обработка матрицы мембраны подвала Matrigel: Оттепель на льду на ночь при 4 градусов по Цельсию. Мембранная матрица подвала является жидкой при низкой температуре, но затвердевает при комнатной температуре. Держите мембранную матрицу подвала на льду(рисунки 1A-B).
2. Обложка Confocal No 1 стеклянного дна блюдо с 50 мкл мембранной матрицы подвала с помощью распространения матрицы с помощью кончика P-200 Pipetman в спиральный узор (рисунок 1C). Используйте осторожность при распространении мембранной матрицы подвала, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Кроме того, избегайте распространения матрицы, чтобы закрыть границы стеклянного дна блюдо для предотвращения образования мениска. Если неопытный обработки мембраны подвала матрицы, а затем предварительно заколол блюдо, P-200 Pipetman и пипетки могут быть на льду (альтернативно оставили на ночь в холодильнике при 4 градусов по Цельсию). Этот шаг предлагает дополнительное время для распространения мембранной матрицы подвала до затвердевания. Поместите блюдо (es) в инкубатор клеточной культуры (при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2) в течение по крайней мере 30 минут, чтобы позволить матрице мембраны подвала затвердеть(рисунок 1D).
3. В то время как матрица проходит затвердевание, трипсинизировать 70-80% слияние 100-мм пластины клеток. После того, как клетки начали подниматься с пластины, повторно посовестью их в 10 мл RPMI 1640 среды, содержащей 10% (v/v) плода бычьей сыворотки (FBS), чтобы инактивировать трипсин (рисунок 1E). Затем перенесите рсуспенные клетки в коническую трубку 15 мл(рисунок 1F).
4. Спин клеток (присутствует в конической трубке) при 100 х г в течение 3 мин в выделенной центрифуге культуры клеток(рисунки 1G-H).
5. В то время как клетки вращаются вниз, aliquot 50 мкл матрицы в 1 мл микроцентрифуг трубки (обратите внимание: каждый стеклянный дном блюдо выделяется одна микроцентрифуг трубки; следовательно, если эксперимент требует 3 блюда, то из этого следует, что 3 микроцентрифуг трубки необходимы, а затем поместить трубку на льду (рисунок 1B).
6. Аспирировать среду от конической трубки от шага 1.4, оставляя гранулы нетронутыми(рисунок 1I). Повторное течение клеток (которые были закручены вниз) в 1 мл FBS-дополненной RPMI среды(рисунок 1J).
7. После того, как клетки подсчитываются с помощью гемоцитометра (рисунок 1K), или счетчик частиц клетки aliquot 2,5 х 104 клеток в микроцентрифуг трубки и доверху его с помощью соответствующих средств массовой информации, с тем чтобы получить общий объем 50 мкл (Рисунок 1L).
8. Смешайте клетки из шага 1.7 (25 000 клеток в 50 мкл) с матричной микроцентрифугой трубки из шага 1,5 в соотношении 1:1; окончательный объем будет 100 мкл(рисунок 1M).
9. Аккуратно пластины 100 мкл матрицы: клеточная смесь из шага 1,8 на затвердевую мембрану подвала матрицы покрытием блюдо из шага 1.2 (Рисунок 1N). Это позволяет встраить клетки в мембранную матрицу подвала.
10. Перенесите блюдо (es) в инкубатор клеточной культуры (при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2) и позвольте матрице:клеточной смеси затвердеть, по крайней мере 30 мин.
11. После того, как матрица: клеточная смесь затвердевет, добавьте 2 мл FBS-дополненных RPMI-медиав блюдо (рисунок 1O) и возьмите блюдо обратно в инкубатор, где оно будет храниться до конца эксперимента (Рисунок 1P).
12. Изменение средств массовой информации каждый день в течение 5 дней (или в соответствии с обязательным для анализа; продолжительность анализа для клеток MDA-MB-231 составляет 5 дней).
13. Используя световой микроскоп, возьмите дифференциальные интерференционные контрастные (DIC) изображения колоний MDA-MB-231, подвешенных в мембранной матрицеподвала (рисунок 2A). Изображение 20 репрезентативных областей с целью 10X один раз в день в течение пяти дней, чтобы определить морфогенез колонии(рисунок 2C).
14. Анализируйте изображения вслепую, чтобы определить образование стеллата клеточной колонии(рисунок 2B). Колония считается stellate, если один или несколько проекций из сфероида клеток воспринимаются. Чтобы определить процент инвазивных колоний стеллата, разделите количество колоний стеллат на общее количество клеточных колоний на приобретенное изображение, а затем в среднем stellate колоний проценты 20 изображений за каждый день.

Representative Results

Рисунок 1. Трехмерная культура клеток рака молочной железы MDA-MB-231 в мембранной матрице подвала (техника встраивания). A-B) Схема экспериментальной установки (выполненной в дымовом капоте). C) Колодец стеклянного дна, покрытый 50 мкл мембранной матрицы подвала. D) Блюдо (es), помещенное в инкубатор культуры клеток (при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2), чтобы позволить матрице затвердеть в течение по крайней мере 30 мин. E) Клетки были трипсинизированы. F) Клетки были повторно использованы в 15 мл конической трубки. G-H) Клетки (присутствующие в конической трубке) вращались вниз на 100 х г в течение 3 мин в центрифуге культуры тканей. I) Сотовые гранулы. J) Клетки (которые были закручены вниз) были resuspended в 1 мл FBS-дополненной среды RPMI. K) Клетки были подсчитаны с помощью гемоцитометра. L) 2,5 х 104 клетки aliquoted в микроцентрифуг трубки и превысила с помощью соответствующих средств массовой информации, с тем чтобы получить общий объем 50 мкл. M) Смешайте клетки из шага 1.7 (25 000 ячеек в 50 мкл) с матричосодержащей микроцентрифугой трубки из шага 1,5 в соотношении 1:1; окончательный объем будет 100 мкл. N) Аккуратно пластина 100 мкл матрицы: клеточная смесь из шага 8 на затверделое матричное покрытие блюдо из шага 1.2. O) После того, как матрица: клеточная смесь затвердева, добавьте 2 мл FBS-дополненных RPMI-медиа в блюдо. P) Поместите блюдо в инкубатор, где оно будет храниться до конца эксперимента.

Рисунок 2. Приобретение изображений и иллюстрация репрезентативных изображений. A) Изображения, сделанные с помощью микроскопа. B) Дифференциальный интерференционный контраст (DIC) визуальный микроскоп, используемый для получения изображений, а затем изображений, анализируемых с помощью программного обеспечения для анализа изображений. C) Показаны репрезентативные изображения клеток MDA-MB-231 (взятые один раз в день в течение пяти дней). В одну сторону ANOVA следуют Несколько тест сравнения Даннетта: q, P Lt; 0.05. Шкала бар, 100 мкм.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)