3D-kultur kjellermembrananalyse: Culturing kreftceller på 3D kjellermembran proteinmatrise for å studere celleinvasjon

Overview

Denne videoen gir en detaljert metodikk for å vokse brystkreftceller i en 3D kjellermembranproteinmatrise, som eksemplifiserer potensialet til 3D-kultur i vurderingen av celleinvasjon i omgivelsene.

Protocol

1. Tredimensjonal kultur av brystkreftceller i kjellermembranmatrisen (innebyggingsteknikken)

1. Håndtering av Matrigel kjellermembranmatrise: Tine på is over natten ved 4 °C. Kjellermembranmatrise er flytende ved lav temperatur, men størkner ved romtemperatur. Oppbevar membranmatrisen i kjelleren på is (Figur 1A-B).
2. Dekk den konfokale no.1 glassbunnsfatet med 50 μl kjellermembranmatrise ved å spre matrisen ved hjelp av spissen av en P-200 Pipetman i et spiralmønster (figur 1C). Vær forsiktig når du sprer kjellermembranmatrisen for å unngå dannelse av luftbobler. På samme måte, unngå å spre matrisen for å lukke grensene til glassbunnsfatet for å forhindre meniskdannelse. Hvis uerfaren håndtering kjellermembranmatrise, deretter forkjølet parabolen, kan P-200 Pipetman og pipetter være på is (alternativt igjen over natten i kjøleskap ved 4 °C). Dette trinnet gir ekstra tid til å spre kjellermembranmatrisen før størkning. Plasser retten(e) i en cellekulturinkubator (ved 37 °C med 5 % CO2) i minst 30 minutter for å gjøre det mulig for kjellermembranmatrisen å størkne (Figur 1D).
3. Mens matrisen gjennomgår størkning, kan du prøve å inspisere en 70-80% konfluent 100 mm plate av celler. Når cellene har begynt å løfte av platen, resuspend dem i 10 ml RPMI 1640 medium som inneholder 10% (v / v) foster bovint serum (FBS), for å inaktivere trypsin (Figur 1E). Overfør deretter de resuspenderte cellene til et konisk rør på 15 ml (figur 1F).
4. Snurr cellene (tilstede i konisk rør) ved 100 x g i 3 min i en dedikert cellekultur sentrifuge (Figur 1G-H).
5. Mens cellene blir spunnet ned, aliquot 50 μl matrise i et 1 ml mikrocentrifugerør (merk: hver glassbunnede tallerken tildeles ett mikrocentrifugerør; derfor, hvis eksperimentet krever 3 retter, så følger det at 3 mikrocentrifuge rør er nødvendige også), og plasser deretter røret på is (Figur 1B).
6. Aspirer mediet fra det koniske røret fra trinn 1.4, mens du lar pelletsen være uforstyrret (Figur 1I). Resuspendceller (som er spunnet ned) i 1 ml FBS-supplert RPMI-medium (figur 1J).
7. Når cellene telles ved hjelp av et hemocytometer (figur 1K), eller en cellepartikkelteller aliquot 2,5 x 104 celler inn i mikrocentrifugerøret og topp det av ved hjelp av passende medier for å oppnå totalt volum på 50 μl (Figur 1L).
8. Bland cellene fra trinn 1,7 (25 000 celler i 50 μl) med det matriseholdige mikrosenterfugerøret fra trinn 1,5 i et 1:1-forhold; sluttvolumet vil være 100 μl (Figur 1M).
9. Tallerken 100 μl av matrisen:celleblanding fra trinn 1.8 på den størknede kjellermembranmatrisebelagte parabolen fra trinn 1.2 (Figur 1N). Dette gjør at celler kan bygges inn i kjellermembranmatrisen.
10. Overfør parabolen(e) inn i cellekulturinkubatoren (ved 37 °C med 5 % CO2) og la matrisen:celleblandingen størkne i minst 30 minutter.
11. Når matrisen:celleblandingen er størknet, tilsett 2 ml FBS-supplert RPMI-medium til parabolen (Figur 1O) og ta parabolen tilbake inkubatoren der den skal lagres for resten av eksperimentet (Figur 1P).
12. Endre medier hver dag i en periode på 5 dager (eller i henhold til nødvendig for en analyse, varigheten av analysen for MDA-MB-231 celler er 5 dager lang).
13. Bruk et lysmikroskop til å ta differensialinterferenskontrastbilder (DIC) av MDA-MB-231-koloniene suspendert i kjellermembranmatrise (figur 2A). Bilde 20 representative områder på 10X mål en gang om dagen i fem dager for å bestemme kolonimorfogenese (Figur 2C).
14. Analyser bilder blindt for å bestemme cellekoloni stellate formasjon (Figur 2B). En koloni anses å være stellate hvis en eller flere projeksjoner fra sfæroiden av celler oppfattes. For å bestemme prosentandelen av invasive stellate-kolonier, del antall stellatekolonier med det totale antallet cellekolonier per ervervet bilde, og gjennomsnittlig deretter stellatekolonienes prosentandeler av de 20 bildene for hver dag.

Representative Results

Figur 1. Tredimensjonal kultur av MDA-MB-231 brystkreftceller i kjellermembranmatrise (innebyggingsteknikken). A-B) Et skjematisk av det eksperimentelle oppsettet (utført i avtrekkshetten). C) Brønnen på den glassbunnede retten belagt med 50 μl kjellermembranmatrise. D) Tallerken(er) plassert i en cellekulturinkubator (ved 37 °C med 5 % CO2) for å la matrisen størkne i minst 30 min. E) Celler ble prøvet. F) Celler ble resuspendert til et 15 ml konisk rør. G-H) Celler (tilstede i konisk rør) ble spunnet ned på 100 x g i 3 min i en vevskultur sentrifuge. I) Cellepellet. J) Celler (som har blitt spunnet ned) ble resuspendert i 1 ml FBS-supplert RPMI medium. K) Celler ble telt ved hjelp av et hemocytometer. L) 2,5 x 104 celler aliquoted inn i mikrocentrifugerøret og toppet ved hjelp av passende medier for å oppnå totalt volum på 50 μl. M) Bland celler fra trinn 1,7 (25 000 celler i 50 μl) med det matriseholdige mikrosenterfugerøret fra trinn 1,5 i et 1:1-forhold; sluttvolumet vil være 100 μl. N) Plater forsiktig 100 μl av matrisen: celleblanding fra trinn 8 til den størknede matrisebelagte parabolen fra trinn 1.2. O) Når matrisen:celleblandingen er størknet, tilsett 2 ml FBS-supplert RPMI-medium til parabolen. P) Plasser retten i inkubatoren der den skal lagres for resten av eksperimentet.

Figur 2. Bildeinnhenting og illustrasjon av representative bilder. A) Bilder tatt med et mikroskop. B) Differensial interferenskontrast (DIC) bildemikroskop som brukes til å skaffe bilder og deretter bilder analysert ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. C) Eksempel representative DIC-bilder av MDA-MB-231 celler (tatt en gang om dagen i fem dager) vises. Enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts multippel sammenligningstest: *, P < 0,05. Skalastang, 100 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)