Test della membrana basale della coltura 3D: coltivare le cellule tumorali sulla matrice proteica della membrana basale 3D per studiare l'invasione cellulare

Overview

Questo video fornisce una metodologia dettagliata per far crescere le cellule tumorali del seno in una matrice proteica della membrana basale 3D, esemplificando il potenziale della coltura 3D nella valutazione dell'invasione cellulare nell'ambiente circostante.

Protocol

1. Coltura tridimensionale delle cellule tumorali del seno nella matrice della membrana basale (la tecnica di incorporamento)

1. Manipolazione della matrice della membrana basale Matrigel: Disgelo sul ghiaccio durante la notte a 4 °C. La matrice della membrana basale è liquida a bassa temperatura ma si solidifica a temperatura ambiente. Mantenere la matrice della membrana basale sulghiaccio (figure 1A-B).
2. Coprire il piatto confocale n. 1 con fondo di vetro con 50 μl di matrice di membrana basale per mezzo di spargere la matrice utilizzando la punta di un pipettante P-200 in un modello a spirale (Figura 1C). Prestare attenzione quando si diffonde la matrice della membrana basale per evitare la formazione di bolle d'aria. Allo stesso modo, evitare di diffondere la matrice vicino ai bordi del piatto con fondo di vetro per prevenire la formazione di menisco. Se la matrice della membrana basale di manipolazione inesperta, preraffredda il piatto, P-200 Pipetman e pipette possono essere sul ghiaccio (in alternativa lasciati durante la notte in frigorifero a 4 °C). Questo passaggio offre ulteriore tempo per diffondere la matrice della membrana basale prima della solidificazione. Posizionare il piatto o i piatti in un incubatore di coltura cellulare (a 37 °C con 5% di CO2) per almeno 30 minuti per consentire alla matrice della membrana basale di solidificarsi(Figura 1D).
3. Mentre la matrice è in fase di solidificazione, tripinare una piastra di cellule 100 mm confluente al 70-80%. Una volta che le cellule hanno iniziato a sollevarsi dalla piastra, le hanno rimescolate in 10 ml di mezzo RPMI 1640 contenente il 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), per inattivare la tripsidena (figura 1E). Quindi trasferire le cellule rimorsi in un tubo conico da 15 ml (Figura 1F).
4. Ruotare le cellule (presenti in tubo conico) a 100 x g per 3 min in una centrifuga di coltura cellulare dedicata (Figure 1G-H).
5. Mentre le cellule vengono filate verso il basso, aliquota 50 μl di matrice in un tubo di microcentrifugo da 1 ml (nota: ad ogni piatto con fondo di vetro viene assegnato un tubo di microcentrifugo; quindi, se l'esperimento richiede 3 piatti, ne consegue che sono necessari anche 3 tubi a microcentrifugo), quindi posizionare il tubo sul ghiaccio(figura 1B).
6. Aspirare il mezzo dal tubo conico dal passo 1.4, lasciando il pellet indisturbato(figura 1I). Cellule resuspend (che sono state scorporate) in 1 ml di mezzo RPMI integrato da FBS (Figura 1J).
7. Una volta contate le cellule utilizzando un emocitometro (Figura 1K) o un contatore di particelle cellulari aliquote 2,5 x 104 nel tubo di microcentrifugo e completarlo utilizzando mezzi appropriati in modo da ottenere un volume totale di 50 μl (Figura 1L).
8. Mescolare le cellule del passo 1.7 (25.000 cellule in 50 μl) con il tubo di microcentrifugo contenente matrici dal passo 1.5 in un rapporto 1:1; il volume finale sarà di 100 μl(Figura 1M).
9. Placcare delicatamente 100 μl della miscela matrice:cella dal passaggio 1.8 sul piatto rivestito con matrice di membrana basale solidificata dal passo 1.2 (Figura 1N). Ciò consente alle cellule di essere incorporate nella matrice della membrana basale.
10. Trasferire il piatto o gli es nell'incubatore di coltura cellulare (a 37 °C con 5% di CO2) e lasciare che la miscela matrice:cella si solidifichi per almeno 30 minuti.
11. Una volta solidificata la miscela matrice:cella, aggiungere 2 ml di supporti RPMI integrati da FBS al piatto (Figura 1O) e rimettere il piatto nell'incubatrice dove sarà conservato per il resto dell'esperimento (Figura 1P).
12. Cambiare il supporto ogni giorno per un periodo di 5 giorni (o come richiesto per un saggio; la durata del test per le celle MDA-MB-231 è di 5 giorni).
13. Utilizzando un microscopio a luce, prendere immagini di contrasto di interferenza differenziale (DIC) delle colonie MDA-MB-231 sospese nella matrice a membrana basale (Figura 2A). Immagine 20 aree rappresentative con obiettivo 10X una volta al giorno per cinque giorni per determinare la morfogenesi della colonia (Figura 2C).
14. Analizzare le immagini alla cieca per determinare la formazione di stellete della colonia cellulare (Figura 2B). Una colonia è considerata stellata se vengono percepite una o più proiezioni dallo sferoide delle cellule. Per determinare la percentuale di colonie stellate invasive, dividere il numero di colonie stellate per il numero totale di colonie cellulari per immagine acquisita, quindi mediare le percentuali di colonie stellate delle 20 immagini per ogni giorno.

Representative Results

Figura 1. Coltura tridimensionale delle cellule tumorali mammali MDA-MB-231 nella matrice della membrana basale (la tecnica di incorporamento). A-B) Schema della configurazione sperimentale (eseguita nella cappa dei fumi). C) Il pozzo del piatto con fondo di vetro rivestito con 50 μl di matrice a membrana basale. D) Piatti collocati in un incubatore di coltura cellulare (a 37 °C con 5% di CO2) per consentire alla matrice di solidificarsi per almeno 30 minuti E) Le cellule sono state tripicinate. F) Le cellule sono state rimorsi in un tubo conico da 15 ml. G-H) Le cellule (presenti nel tubo conico) sono state sfume a 100 x g per 3 minuti in una centrifuga di coltura tissutale. I) Pellet di cellule. J) Le cellule (che sono state scorporate) sono state rimonite in 1 ml di mezzo RPMI integrato da FBS. K) Le cellule sono state contate usando un emocitometro. L) 2,5 x 104 celle aliquote nel tubo di microcentrifugo e sormontate con mezzi appropriati in modo da ottenere un volume totale di 50 μl. M) Mescolare le cellule del passo 1.7 (25.000 cellule in 50 μl) con il tubo di microcentrifugo contenente matrici dal passo 1.5 in un rapporto 1:1; volume finale sarà di 100 μl. N) Placcare delicatamente 100 μl della matrice: miscela cellulare dal passaggio 8 sul piatto solidificato rivestito a matrice dal passo 1.2. O) Una volta solidificata la miscela matrice:cella, aggiungere 2 ml di supporti RPMI integrati da FBS al piatto. P) Posizionare il piatto nell'incubatrice dove verrà conservato per il resto dell'esperimento.

Figura 2. Acquisizione di immagini e illustrazione di immagini rappresentative. A) Immagini scattate al microscopio. B) Microscopio di imaging DIC (Differential Interference Contrast) utilizzato per acquisire immagini e successivamente immagini analizzate utilizzando il software di analisi delle immagini. C) Vengono mostrate immagini DIC rappresentative di esempio di cellule MDA-MB-231 (scattate una volta al giorno per cinque giorni). ANOVA unirivolta seguito dal test di confronto multiplo di Dunnett: *, P < 0.05. Barra di scala, 100 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)