3D-cultuur keldermembraantest: cultiveren van kankercellen op 3D-keldermembraaneiwitmatrix om celinvasie te bestuderen

Overview

Deze video biedt een gedetailleerde methodologie om borstkankercellen te laten groeien in een 3D-keldermembraaneiwitmatrix, die het potentieel van 3D-cultuur illustreert bij de beoordeling van celinvasie in de omgeving.

Protocol

1. Driedimensionale cultuur van borstkankercellen in keldermembraanmatrix (de inbeddingstechniek)

1. Behandeling Matrigel keldermembraanmatrix: Ontdooi 's nachts op ijs bij 4 °C. Keldermembraanmatrix is vloeibaar bij lage temperatuur, maar stolt bij kamertemperatuur. Houd keldermembraanmatrix op ijs (Figuren 1A-B).
2. Bedek de confocale no.1 glazen bodemschaal met 50 μl keldermembraanmatrix door de matrix te spreiden met behulp van de punt van een P-200 Pipetman in een spiraalpatroon (figuur 1C). Wees voorzichtig bij het verspreiden van de keldermembraanmatrix om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Vermijd ook het verspreiden van de matrix tot dicht bij de randen van de schotel met glazen bodem om meniscusvorming te voorkomen. Als onervaren omgaan met keldermembraanmatrix, dan voorgekoeld de schotel, P-200 Pipetman en pipetten kunnen op ijs (alternatief 's nachts in een koelkast bij 4 °C). Deze stap biedt extra tijd om de keldermembraanmatrix te spreiden voor de stolling. Plaats de schaal(en) gedurende ten minste 30 minuten in een celkweek-incubator (bij 37 °C met 5% CO2) om de keldermembraanmatrix te laten stollen (figuur 1D).
3. Terwijl de matrix stolling ondergaat, trypsinize een 70-80% samenvloeiende 100 mm plaat van cellen. Zodra de cellen van de plaat zijn begonnen, resuspendeer ze in 10 ml RPMI 1640 medium met 10% (v/v) foetale runderserum (FBS), om de trypsine te inactiveren (figuur 1E). Breng vervolgens de geresuspendeerde cellen over in een conische buis van 15 ml (figuur 1F).
4. Draai de cellen (aanwezig in conische buis) gedurende 3 minuten op 100 x g in een speciale celkweekcentrifuge (Figuren 1G-H).
5. Terwijl de cellen naar beneden worden gesponnen, moet 50 μl matrix in een microcentrifugebuis van 1 ml worden gesmeerd (let op: elke schotel met glazen bodem krijgt één microcentrifugebuis toegewezen; dus als het experiment 3 schotels vereist, dan volgt hieruit dat er ook 3 microcentrifugebuizen nodig zijn) en plaatst u de buis vervolgens op ijs (figuur 1B).
6. Aspireer het medium vanaf stap 1.4 uit de conische buis, terwijl u de pellet ongestoord laat (figuur 1I). Resuspendcellen (die zijn afgesplitseld) in 1 ml met FBS aangevuld RPMI-medium (Figuur 1J).
7. Zodra de cellen zijn geteld met behulp van een hemocytometer (figuur 1K), of een celdeeltje teller aliquot 2,5 x 104 cellen in de microcentrifuge buis en maak het af met behulp van de juiste media om het totale volume van 50 μl te verkrijgen (Figuur 1L).
8. Meng de cellen uit stap 1.7 (25.000 cellen in 50 μl) met de matrixbevattende microcentrifugebuis uit stap 1.5 in een verhouding van 1:1; eindvolume is 100 μl (figuur 1M).
9. Plaat voorzichtig 100 μl van de matrix: celmengsel vanaf stap 1.8 op de gestolde keldermembraan matrix-gecoate schotel vanaf stap 1.2 (Figuur 1N). Hierdoor kunnen cellen worden ingebed in keldermembraanmatrix.
10. Breng de schaal(en) over in de celkweek-incubator (bij 37 °C met 5% CO2) en laat het matrix:celmengsel minstens 30 minuten stollen.
11. Zodra het matrix:celmengsel is gestold, voegt u 2 ml met FBS aangevulde RPMI-media toe aan de schaal (figuur 1O) en neemt u de schaal terug naar de incubator waar deze voor de rest van het experiment wordt opgeslagen (figuur 1P).
12. Verander media elke dag gedurende een periode van 5 dagen (of zoals vereist voor een test; de duur van de test voor MDA-MB-231 cellen is 5 dagen lang).
13. Maak met behulp van een lichtmicroscoop differentiële interferentiecontrastbeelden (DIC) van de MDA-MB-231-kolonies die zijn opgehangen in de keldermembraanmatrix (figuur 2A). Afbeelding 20 representatieve gebieden bij 10X doelstelling eenmaal per dag gedurende vijf dagen om koloniemorfogenese te bepalen (Figuur 2C).
14. Analyseer afbeeldingen blindelings om de stellate vorming van celkolonies te bepalen (Figuur 2B). Een kolonie wordt als stellaat beschouwd als een of meer projecties van de sferoïde van cellen worden waargenomen. Om het percentage invasieve stellate kolonies te bepalen, deel het aantal stellate kolonies door het totale aantal celkolonies per verworven beeld, en dan gemiddeld de stellate kolonies percentages van de 20 beelden voor elke dag.

Representative Results

Figuur 1. Driedimensionale cultuur van MDA-MB-231 borstkankercellen in keldermembraanmatrix (de inbeddingstechniek). A-B) Een schema van de experimentele opstelling (uitgevoerd in de zuurkast). C) De put van de schotel met glazen bodem bedekt met 50 μl keldermembraanmatrix. D) Schotel(s) geplaatst in een celkweekincubator (bij 37 °C met 5% CO2) om de matrix minstens 30 min. E te laten stollen) Cellen werden trypsinized. F) Cellen werden geresuspendeerd in een conische buis van 15 ml. G-H) Cellen (aanwezig in conische buis) werden met 100 x g gedurende 3 minuten in een weefselkweekcentrifuge naar beneden gesponnen. I) Celkorrel. J) Cellen (die zijn afgesplitseld) werden geresuspendeerd in 1 ml met FBS aangevuld RPMI-medium. K) Cellen werden geteld met behulp van een hemocytometer. L) 2,5 x 104 cellen in de microcentrifugebuis geciteerd en met behulp van geschikte media aangevuld om een totaal volume van 50 μl te verkrijgen. M) Meng cellen uit stap 1.7 (25.000 cellen in 50 μl) met de matrixbevattende microcentrifugebuis uit stap 1.5 in een verhouding van 1:1; eindvolume zal 100 μl zijn. N) Plaat voorzichtig 100 μl van de matrix: celmengsel vanaf stap 8 op de gestolde matrixomhulde schaal vanaf stap 1.2. O) Zodra het matrix:celmengsel is gestold, voegt u 2 ml FBS-aangevulde RPMI-media toe aan de schaal. P) Plaats de schaal in de incubator waar deze voor de rest van het experiment wordt bewaard.

Figuur 2. Beeldverwerving en illustratie van representatieve beelden. A) Foto's gemaakt met een microscoop. B) Differentiële interferentiecontrast (DIC) beeldmicroscoop die wordt gebruikt om beelden te verkrijgen en vervolgens beelden die worden geanalyseerd met behulp van beeldanalysesoftware. C) Voorbeeld representatieve DIC-beelden van MDA-MB-231 cellen (eenmaal daags gedurende vijf dagen genomen) worden getoond. Enkele reis ANOVA gevolgd door Dunnett's meervoudige vergelijkingstest: *, P < 0,05. Schaalbalk, 100 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)