3D-Kultur-Keller-Membran-Assay: Kultivieren von Krebszellen auf 3D Basement Membrane Protein Matrix zur Untersuchung der Zellinvasion

Overview

Dieses Video bietet eine detaillierte Methodik zum Wachstum von Brustkrebszellen in einer 3D-Kellermembran-Proteinmatrix, die das Potenzial der 3D-Kultur bei der Bewertung der Zellinvasion in die Umgebung veranschaulicht.

Protocol

1. Dreidimensionale Kultur von Brustkrebszellen in Basement Membrane Matrix (The Embedment Technique)

1. Handhabung der Matrigel-Kellermembranmatrix: Über Nacht bei 4 °C auf Eis auftauen. Die Kellermembranmatrix ist bei niedriger Temperatur flüssig, erstarrt aber bei Raumtemperatur. Kellermembranmatrix auf Eis halten (Abbildungen 1A-B).
2. Bedecken Sie die konfokale Glasbodenschale Nr.1 mit 50 l Kellermembranmatrix, indem Sie die Matrix mit der Spitze eines P-200 Pipetman in einem Spiralmuster verteilen (Abbildung 1C). Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Kellermembranmatrix verteilen, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Ebenso vermeiden Sie die Ausbreitung der Matrix auf die Grenzen der Glasbodenschale, um Meniskusbildung zu verhindern. Wenn unerfahrene Umgang Keller Membran Matrix, dann vorgekühlt die Schale, P-200 Pipetman und Pipetten können auf Eis sein (alternativ über Nacht im Kühlschrank bei 4 °C gelassen). Dieser Schritt bietet zusätzliche Zeit, um die Kellermembranmatrix vor der Erstarrung zu verteilen. Legen Sie die Schale(en) mindestens 30 min in einen Zellkultur-Inkubator (bei 37 °C mit 5 % CO2), damit sich die Kellermembranmatrix erstarren kann (Abbildung 1D).
3. Während die Matrix erstarrt wird, versuchen Sie eine 70-80% konfluente 100-mm-Platte von Zellen. Sobald die Zellen begonnen haben, die Platte abzuzuheben, setzen Sie sie in 10 ml RPMI 1640 Medium mit 10% (v/v) fetalem Rinderserum (FBS) wieder auf, um das Trypsin zu inaktivieren (Abbildung 1E). Dann übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein 15 ml konisches Rohr (Abbildung 1F).
4. Drehen Sie die Zellen (in konischem Rohr vorhanden) bei 100 x g für 3 min in einer speziellen Zellkulturzentrifuge (Abbildungen 1G-H).
5. Während die Zellen nach unten gesponnen werden, aliquot 50 l Matrix in ein 1 ml Mikrozentrifugenrohr (Hinweis: jede Glasbodenschale wird ein Mikrozentrifugenrohr zugeordnet; daher, wenn das Experiment 3 Gerichte erfordert, dann folgt daraus, dass 3 Mikrozentrifugenröhrchen sind auch notwendig), und dann legen Sie die Röhre auf Eis (Abbildung 1B).
6. Das Medium aus Schritt 1.4 aus dem konischen Rohr ansaugen, während das Pellet ungestört bleibt (Abbildung 1I). Resuspend-Zellen (die nach unten gesponnen wurden) in 1 ml FBS-ergänztem RPMI-Medium (Abbildung 1J).
7. Sobald die Zellen mit einem Hämozytometer (Abbildung 1K) oder einem Zellpartikelzähler aliquot 2,5 x 104 Zellen in das Mikrozentrifugenrohr gezählt werden, und toppt es mit geeigneten Medien, um ein Gesamtvolumen von 50 l zu erhalten (Abbildung 1L).
8. Mischen Sie die Zellen aus Schritt 1,7 (25.000 Zellen in 50 l) mit dem matrixhaltigen Mikrozentrifugenrohr ab Schritt 1,5 im Verhältnis 1:1; Endvolumen beträgt 100 l (Abbildung 1M).
9. Schonende Platte 100 l der Matrix:Zellmischung von Schritt 1.8 auf die erstarrte Kellermembran-Matrix-beschichtete Schale ab Schritt 1.2 (Abbildung 1N). Dadurch können Zellen in die Kellermembranmatrix eingebettet werden.
10. Übertragen Sie die Schale(en) in den Zellkultur-Inkubator (bei 37 °C mit 5% CO2) und lassen Sie die Matrix:Zell-Mischung für mindestens 30 min erstarren.
11. Sobald die Matrix:Zell-Mischung erstarrt ist, fügen Sie 2 ml FBS-ergänzte RPMI-Medien in die Schale ein (Abbildung 1O) und nehmen Sie die Schale zurück in den Inkubator, wo sie für den Rest des Experiments gelagert wird (Abbildung 1P).
12. Wechseln Sie die Medien jeden Tag für einen Zeitraum von 5 Tagen (oder nach Bedarf für einen Test; die Dauer des Assays für MDA-MB-231-Zellen beträgt 5 Tage lang).
13. Mit einem Lichtmikroskop nehmen Sie Differential Interferenzkontrast (DIC) Bilder der MDA-MB-231 Kolonien, die in der Kellermembranmatrix aufgehängt sind (Abbildung 2A). Bild 20 repräsentative Bereiche bei 10X Ziel einmal täglich für fünf Tage, um Koloniemorphogenese zu bestimmen (Abbildung 2C).
14. Analysieren Sie Bilder blind, um die stellate Zellkoloniebildung zu bestimmen (Abbildung 2B). Eine Kolonie gilt als stellatiert, wenn eine oder mehrere Projektionen aus dem Sphäroid der Zellen wahrgenommen werden. Um den Prozentsatz der invasiven stellaten Kolonien zu bestimmen, teilen Sie die Anzahl der stellaten Kolonien durch die Gesamtzahl der Zellkolonien pro erworbenem Bild, und durchschnittlich die stellaten Kolonien Prozentsätze der 20 Bilder für jeden Tag.

Representative Results

Abbildung 1. Dreidimensionale Kultur von MDA-MB-231 Brustkrebszellen in der Kellermembranmatrix (die Einbettungstechnik). A-B) Ein Schaltplan des Versuchsaufbaus (durchgeführt in der Dunstabzugshaube). C) Der Brunnen der Glasbodenschale, der mit einer Kellermembranmatrix von 50 l beschichtet ist. D) Dish(en) in einem Zellkultur-Inkubator (bei 37 °C mit 5% CO2) platziert, damit die Matrix für mindestens 30 min verfestigt werden kann. E) Zellen wurden trypsinisiert. F) Die Zellen wurden in ein 15 ml konisches Rohr resuspendiert. G-H) Zellen (in konischen Röhrchen vorhanden) wurden bei 100 x g für 3 min in einer Gewebekulturzentrifuge nach unten gesponnen. I) Zellpellet. J) Zellen (die nach unten gesponnen wurden) wurden in 1 ml FBS-ergänztem RPMI-Medium resuspendiert. K) Zellen wurden mit einem Hämozytometer gezählt. L) 2,5 x 104 Zellen, die in das Mikrozentrifugenrohr eingepfert und mit geeigneten Medien abgefüllt werden, um ein Gesamtvolumen von 50 l zu erhalten. M) Mischen Sie Zellen aus Schritt 1,7 (25.000 Zellen in 50 l) mit dem matrixhaltigen Mikrozentrifugenrohr ab Schritt 1,5 im Verhältnis 1:1; Endvolumen wird 100 l betragen. N) Schonige Platte 100 l der Matrix: Zellmischung von Schritt 8 auf die erstarrte Matrix-beschichtete Schale ab Schritt 1.2. O) Sobald die Matrix:Zell-Mischung erstarrt ist, fügen Sie 2 ml FBS-ergänzte RPMI-Medien in die Schale. P) Legen Sie die Schale in den Inkubator, wo sie für den Rest des Experiments gelagert wird.

Abbildung 2. Bildaufnahme und Illustration repräsentativer Bilder. A) Bilder, die mit einem Mikroskop aufgenommen wurden. B) Dic-Bildmikroskop (Differential Interference Contrast) zur Erfassung von Bildern und anschließend mit Hilfe einer Bildanalysesoftware analysierten Bildern. C) Beispiel repräsentative DIC-Bilder von MDA-MB-231-Zellen (einmal täglich für fünf Tage aufgenommen) werden gezeigt. Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest: *, P < 0.05. Schuppenstange, 100 m.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	CA10011-700
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)