Summary
Utilizzando un spettralmente risolta a due fotoni sistema di imaging microscopia, a livello di pixel mappe di Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficienze sono ottenute per le cellule che esprimono recettori di membrana ipotizzato per formare omo-oligomeriche complessi. Dal FRET mappe efficienza, siamo in grado di stimare le informazioni stechiometrico sui complessi oligomeri in fase di studio.
Abstract
Lo studio delle interazioni delle proteine nelle cellule viventi è una zona importante della ricerca perché le informazioni accumulate entrambe le applicazioni industriali vantaggi così come gli aumenti di base conoscenze di base biologica. Förster (fluorescenza) Resonance Energy Transfer (FRET) tra una molecola donatore in uno stato elettronicamente eccitato e una molecola accettore vicino è stato spesso utilizzato per lo studio di interazioni proteina-proteina nelle cellule viventi. Le proteine di interesse sono contrassegnati da due diversi tipi di sonde fluorescenti ed espressi in cellule biologiche. Le sonde fluorescenti vengono eccitati, in genere utilizzando la luce laser, e le proprietà spettrali delle emissioni di fluorescenza provenienti dalle sonde fluorescenti vengono raccolti e analizzati. Le informazioni relative al grado di interazioni proteina è incorporato nei dati di emissione spettrale. Tipicamente, la cellula deve essere analizzato un certo numero di volte in modo da accumulare abbastanza informazioni spettrali di quantificare con esattezza la portata delle interazioni proteina per ogni regione di interesse all'interno della cellula. Tuttavia, la composizione molecolare di queste regioni può cambiare durante il corso del processo di acquisizione, limitando la determinazione spaziale dei valori quantitativi di apparente efficienza FRET ad una media di cellule intere. Per mezzo di un spettralmente risolta microscopio a due fotoni, siamo in grado di ottenere un set completo di immagini spettralmente risolta solo dopo una scansione completa eccitazione del campione di interesse. Da questi dati spettrali a livello di pixel, una mappa di FRET efficienza per tutta la cella è calcolato. Applicando una semplice teoria di FRET in complessi oligomeriche alla distribuzione sperimentalmente ottenuto di FRET efficienza in tutta la cellula, una singola scansione spettralmente risolta rivela informazioni stechiometrico e strutturali per il complesso oligomeri in fase di studio. Qui si descrive la procedura di preparazione di cellule biologiche (il lievito Saccharomyces cerevisiae) che esprimono recettori di membrana (sterile 2 recettori α-factor) taggati con due diversi tipi di sonde fluorescenti. Inoltre, illustrare i fattori critici coinvolti nella raccolta di dati utilizzando la fluorescenza spettralmente risolta a due fotoni sistema di imaging microscopia. L'utilizzo di questo protocollo può essere estesa allo studio di qualsiasi tipo di proteina che può essere espresso in una cellula vivente con un marcatore fluorescente collegato ad esso.
Protocol
1. Progettazione plasmide
Le proteine di interesse sono fuse in una delle due etichette diverse fluorescenti, come descritto di seguito. Le etichette fluorescenti non solo forniscono informazioni sulla posizione delle proteine all'interno della cellula, ma anche informazioni quantitative in materia di omo-oligomerizzazione della proteina 1. La tecnica della fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET) 2-4 viene usato per raccogliere le informazioni sulle interazioni proteina 5-10. FRET utilizza il principio che un trasferimento di energia può avvenire da una molecola otticamente eccitati (generalmente indicato come il donatore, D) di una molecola non eccitato (generalmente indicato come accettore, A) attraverso interazioni dipolo-dipolo 11, se le due molecole sono in stretta vicinanza l'uno all'altro. Nel progettare i plasmidi codifica le proteine di fusione, due caratteristiche chiave dovrebbe essere tenuto presente, come segue.
- Selezione di un paio di tag compatibile fluorescenti è della massima importanza in FRET studi. Idealmente, la combinazione tag fluorescenti deve soddisfare due criteri: una sovrapposizione apprezzabile lunghezze d'onda tra lo spettro di emissione del tag donatore e lo spettro di eccitazione del tag accettore, e una grande separazione tra la lunghezza d'onda centro dello spettro impulso laser e lo spettro di eccitazione del accettore (cioè, grande spostamento di Stokes). Due varianti della proteina fluorescente verde 12, 13 sono particolarmente adatti a soddisfare questi criteri: la GFP 2 come donatore di 14 e la proteina gialla fluorescente (YFP) 12 o una variante di esso chiamato Venere 15, come l'accettante. Cerulean 16 potrebbe essere usato anche come un donatore, anche se con risultati un po 'più modesti.
- In termini quantitativi FRET immagini è meglio se solo uno dei donatori in un complesso molecolare è entusiasta alla volta (in media), in modo che nessuna concorrenza si verifica tra i donatori per il trasferimento di energia al accettore stessi complessi che contengono più di un donatore e un accettore . Questo porta a semplificazioni nella teoria e analisi dei dati di processo 17. A causa di ciò, il livello del segnale è solitamente basso. Per compensare questo, il livello di espressione delle proteine di interesse dovrebbe essere relativamente elevata. Elevati livelli di espressione sono realizzati utilizzando una copia ad alta plasmide di portare il gene della proteina nella cellula.
2. Lievito di trasformazione
E 'vantaggioso per massimizzare la percentuale di popolazione di cellule che esprimono i costrutti proteina di interesse. A tal fine, trasformiamo auxotrophic un ceppo di cellule di lievito (Saccharomyces cerevisiae), incapace di produrre triptofano o uracile, con due plasmidi diversi, uno contenente il triptofano selezionabili marcatore e uno dei uracile marcatore. I plasmidi contengono anche i geni che portano le istruzioni per la cellula di esprimere la proteina di interesse taggati con una delle due sonde fluorescenti. Le cellule trasformate sono coltivate su piastre terreno solido che mancano anche triptofano e uracile. Almeno tre tipi di cellule devono essere trasformate: cellule che esprimono le proteine di interesse taggati con entrambi i tipi di sonde fluorescenti, cellule che esprimono proteine solo taggati con le sonde fluorescenti donatore e le cellule che esprimono proteine solo taggati con le sonde fluorescenti accettore.
- Preparare piatti terreno solido (1,7 g / L di azoto lievito di base w / o aminoacidi, 1,6 g / L di lievito sintetico di abbandono medio w / o uracile e triptofano, 2% [w / v] glucosio, 2% [w / v] agar) da utilizzare come mezzo di crescita per le cellule trasformate almeno un giorno prima della trasformazione cellulare. Le piastre di terreno solido può essere utilizzato per un massimo di due mesi dopo la preparazione se rimangono privi di contaminanti.
- Per ogni coppia plasmide da trasformare, aggiungere 10 ml di YPD (10 g / l estratto di lievito Bacto, 20 g / L Bacto peptone, e il 2% [w / v] glucosio) a una beuta. Incoluate il YPD con una colonia del ceppo auxotrophic di cellule di lievito da trasformare.
- Collocare la beuta contenente la coltura di lievito in uno shaker laboratorio, che fornisce un orbitale vorticoso sui campioni, e incubare una notte a 30 ° C. La mattina seguente, avviare il monitoraggio della crescita della coltura cellulare periodicamente la rimozione di un piccolo volume di la cultura e la sperimentazione sua densità ottica (OD). La crescita della coltura cellulare dovrebbe essere a metà logaritmica fase, cioè un diametro esterno di 0,5-1,0, al momento della trasformazione.
- Depositare 5 ml di entrambi i tipi di plasmidi in una provetta sterile per ogni coppia plasmide da trasformare.
- Per ogni coppia plasmide da trasformare, aggiungere 5 ml di DNA dello sperma di salmone (5 mg / ml) ad una provetta vuota. Immergere la metà inferiore della provetta contenente il DNA dello sperma di salmone in acqua bollente per cinque minuti. Per evitare che il tappo della provetta da op poppingit, immergere solo la metà inferiore dei tubi microcentrifuga in acqua. Dopo aver rimosso dall'acqua bollente, mettere il provetta contenente il DNA dello sperma di salmone in ghiaccio per almeno due minuti.
- Aggiungere 5 ml di DNA dello sperma di salmone ad ogni provetta contenente plasmidi.
- Misurare il diametro esterno della cultura lievito crescente per confermare che ha raggiunto a metà logaritmica fase (cioè la lettura OD sono compresi tra 0,5 e 1,0).
- Centrifugare la sospensione di lievito in 1000xg per due minuti.
- Eliminare il sopranatante e risospendere il lievito pellet in acqua deionizzata sterile utilizzando un vortex.
- Centrifugare la sospensione ancora una volta al 1000xg per due minuti.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in una soluzione di 0.1M LiOAc a TE (1,02 g LIAC, 10 ml di 1M Tris a pH 7,4, e 10 mL 0,1 M EDTA a pH 8,0). Il volume di 0,1 M LiOAc in TE dovrebbe essere uguale a 1 / 100 ° del volume originale coltura di lievito in YPD.
- Distribuire 100 ml di cellule a ciascuno dei tubi microcentrifuga contenente i plasmidi. Flick ogni tubo delicatamente per mescolare le celle con i plasmidi.
- Aggiungere 400 ml di 44% [w / v] polietilenglicole (PEG 4000) la soluzione ad ognuno dei tubi microcentrifuga.
- Mescolare delicatamente il PEG 4000 con le cellule e plasmidi. Al fine di evitare di rompere le cellule, non utilizzare un vortex a questo punto. Per mescolare delicatamente, tenere premuto il tappo microcentrifuga e la parte inferiore della provetta tra indice e pollice, lentamente invertire il tubo, e poi portare lentamente il tubo nella posizione eretta. Ruotare il tubo di 90 ° attorno al proprio asse cilindrico e lentamente inverte di nuovo. Ripetere questo processo un certo numero di volte in modo che le cellule scivolare l'intera superficie delle pareti della provetta.
- Posizionare i tubi in una microcentrifuga ° 30 incubatore per 45 minuti.
- Dopo 45 minuti di incubazione, rimuovere le cellule dal termostato e ripetere la procedura di dolce mescolando descritti in 14.
- Posizionare i tubi microcentrifuga in un bagno d'acqua ° 42 e incubare per 15 minuti. Ancora una volta, solo immergere la metà inferiore dei tubi microcentrifuga in acqua.
- Dopo l'incubazione 42 °, aggiungere 1 ml di acqua deionizzata sterile per i tubi microcentrifuga.
- Centrifugare le provette in una microcentrifuga da tavolo per 5 secondi. Eliminare il surnatante dai tubi con un micropipetter.
- Aggiungere 100 ml di acqua deionizzata sterile a ciascuno dei tubi microcentrifuga e mescolare l'acqua sterile deionizzata con le cellule con il processo di inversione.
- Aggiungere il contenuto di una provetta solo per un piatto medio di crescita che seleziona per i plasmidi particolare aggiunge a quella provetta. Aggiungere 4-6 perle di vetro sterilizzati (1 mm di diametro). Agitare il piatto contenente la gocciolina di cellule di lievito trasformate e perle di vetro in modo che le cellule sono in tutta la superficie del terreno di coltura agar. Ripetere questo processo per ogni gruppo di cellule trasformate.
- Posizionare le piastre in incubatore di 30 ° per 3 - 5 giorni. Dopo 3-5 giorni, le colonie di lievito più di 1-3 mm di diametro sarà visibile sulla superficie del terreno di crescita. In questo momento, le cellule sono pronte per essere ripreso nel spettralmente risolta microscopio a due fotoni.
3. Calibrazione del spettralmente risolta microscopio a due fotoni
Il spettralmente risolte microscopio a due fotoni utilizzati in questi studi è stato descritto in dettaglio altrove 18, 19. In breve, ad alta potenza laser a stato solido ad onda continua viene utilizzato per pompare un modo bloccato Ti: Sapphire laser che genera impulsi a femtosecondi di lunghezze d'onda che vanno da ~ 750 e 830 nm. Il raggio laser viene focalizzato da un obiettivo ad alta microscopio NA ad una diffrazione limitata posto sul campione. Eccitazione si verifica solo nella regione vicino focale del fascio a causa della bassa probabilità di eccitazione a due fotoni. Un paio di ortogonali controllati dal computer specchi di scansione vengono utilizzati per convertire la messa a fuoco del fascio nel piano del campione in due direzioni diverse (denominate direzioni x ed y in tutto il protocollo). Il retro-propagazione emissione di fluorescenza da un voxel illuminato del campione è dispersa in componenti spettrali da un reticolo di trasmissione inserito nel percorso della prima emissione della luce cade incidente sul pixel di EM-CCD array. Così, il profilo completo spettrale di ogni molecola fluorescente / molecole all'interno della regione focale del fascio è ottenuta lungo una sola dimensione (direzione y) del CCD. Utilizzando il movimento di uno dei due specchi di scansione, la posizione del fuoco del laser possono essere acquisiti all'interno del campione lungo una linea perpendicolare alla direzione y. Mantenendo l'otturatore della fotocamera CCD aperto durante la scansione singola linea, i profili spettrale della res molecole fluorescentiiding lungo l'intera linea di scansione sono raccolti in una sola passata del raggio laser in tutto il campione. Accumulare scansioni più righe di questa natura in luoghi y diverse all'interno della cellula dà i profili spettrali di un gran numero di complessi fluorescenti che risiedono all'interno del campione. Le immagini ottenute dalla scansione di linea sono ricostruite per dare più intensità di fluorescenza mappe xy spaziale del campione a diverse lunghezze d'onda 18, 19. Al fine di ricostruire con precisione e calcolare la lunghezza d'onda corrispondente al reale fluorescenti mappe intensità xy spaziale, il protocollo di scansione di linea deve essere calibrato utilizzando un campione con uno spettro ben caratterizzato emissione di fluorescenza.
- Il spettralmente risolte microscopio a due fotoni si accumula informazioni spettrali sulla complessi oligomero nella cella ripreso scansione del centro del fascio di eccitazione in tutto il campione di interesse in un numero di posizioni.
- Una coppia di specchi di scansione ortogonale viene utilizzato per tradurre la messa a fuoco del raggio laser attraverso il campione in due direzioni diverse. Il movimento degli specchi di scansione è controllata dal computer e sincronizzato con l'estrazione dei dati di intensità di fluorescenza dalla fotocamera CCD.
- Dalle scansioni linea, le mappe di intensità fluorescente territoriali corrispondenti ad una particolare lunghezza d'onda della luce può essere ricostruita. Al fine di ricostruire con precisione le mappe di intensità fluorescente xy spaziale e calcolare la lunghezza d'onda reali corrispondenti a ciascuna di queste mappe, il protocollo di scansione linea deve essere calibrato utilizzando una soluzione di fluoresceina.
- Per iniziare la procedura di calibrazione, il centro dello spettro di eccitazione alla lunghezza d'onda di 800 nm, che è di 2 volte la lunghezza d'onda di eccitazione massima del tag donatore, GFP 2. Per centrare lo spettro di eccitazione, tradurre il prisma situato all'interno della cavità laser per modificare la dispersione di velocità di gruppo. Il prisma è montato su un computer controllato lineare stadio motorizzato.
- Utilizzando il programma del computer la fotocamera è interfacciato, inviare un comando al chip CCD per abbassare la temperatura del chip CCD alla sua più bassa temperatura raggiungibile in modo da ridurre il rumore scuro.
- Pipettare 10 ml di soluzione di fluoresceina su un vetrino da microscopio. Coprire con un coprioggetto in modo che un sottile strato del campione sia uniformemente distribuito nella regione tra il vetrino e il vetrino da microscopio.
- Mettere una piccola goccia di olio di immersione sulla superficie del vetrino coprioggetto
- Ora fissare il vetrino da microscopio alla fase di traduzione xyz e tradurre il vetrino / stage in direzione dell'asse ottico regolando manualmente l'attuatore lineare che controlla il movimento scenico nella direzione dell'asse ottico. Tradurre il vetrino / stage fino a quando il microscopio obiettivo viene a contatto con la goccia di olio da immersione.
- Utilizzando il programma per computer che controlla la fotocamera, passare a una modalità video di acquisizione dati in modo la luce emessa colpisce il CCD viene visualizzato sullo schermo del computer in tempo reale. Lentamente, regolare il micrometro controllare la fase di traduzione in direzione dell'asse ottico per portare il campione nel punto focale del raggio laser.
- Quando il campione fluoresceina è a fuoco, l'emissione apparirà come una linea netta sul CCD. Scarica la lettura delle intensità dei pixel della matrice CCD al computer utilizzando il programma informatico di controllo della fotocamera. Misurare l'intensità dei pixel in funzione della posizione sul CCD aprendo la matrice di valori di intensità scaricato in J immagini e tracciando una linea attraverso la regione fluorescente. Utilizzare il comando J Immagine Analizzare Plot → profilo per creare un grafico che illustra lo spettro di emissione del campione fluoresceina.
- Regolare il parametro incrementale dello specchio che controlla il movimento del fuoco del laser nella direzione y, tale che le posizioni y adiacenti all'interno il risultato del campione nel movimento del picco degli spettri di fluorescenza da esattamente un pixel lungo la dimensione spettrale del CCD array. Monitorare questo scaricando l'immagine spettri fluoresceina intensità valore per y due posizioni diverse nel campione, aprendo le immagini intensità con J Immagine, e trovare la posizione di punta pixel per ciascuno degli spettri di fluorescenza utilizzando il cursore J immagine.
- Lasciando l'otturatore aperto del CCD, la scansione del fuoco del laser in tutto il campione in direzione x. La luce emessa da ogni voxel lungo la linea della scansione dovrebbe cadere incidente sul CCD.
- Conservare i dati dal CCD ottenute per questa linea di scansione e quindi cancellare i pixel del CCD.
- Spostare la posizione del fuoco del laser nella direzione y per l'importo determinato al punto 11 della presente sezione.
- Scansione del fascio laser nella direzione x tutto il campione, ancora una volta, lasciando aperta l'otturatore della ar CCDray e memorizzare i dati.
- Ripetere questa procedura linea di scansione fino a uno spazio fisico ~ 50% più grande rispetto alle dimensioni di una singola cellula biologica è stata illuminata da luce laser.
- Il rapporto tra numero di riga di una particolare immagine di scansione di linea e lunghezza d'onda dovrebbe essere usato per ricostruire le immagini di ottenere mappe più intensità fluorescente xy territoriale a diverse lunghezze d'onda. Per ottenere l'immagine xy emissione di fluorescenza di una particolare lunghezza d'onda (λ j), trovare il numero di riga sulle immagini ottenute dalla scansione prima riga che corrisponde a questa lunghezza d'onda. Poi la fila adiacenti dell'immagine successiva linea di scansione corrisponde alla riga successiva dell'immagine emissione di fluorescenza per quella particolare lunghezza d'onda. Stack tutte le righe dell'immagine che corrispondono a questa lunghezza d'onda per ottenere il fluorescenti mappe intensità spaziale xy del campione a quella lunghezza d'onda. Ripetere questa procedura per tutte le altre lunghezze d'onda ottenibili.
- Per calcolare la lunghezza d'onda associato ad ogni carta fluorescente di intensità xy spaziali, determinare il fondo corretta normalizzata intensità di fluorescenza di ogni immagine ricostruita in funzione di indice dell'immagine (j). Il rapporto tra la posizione dei pixel della telecamera nella dimensione spettrale e la lunghezza d'onda dei fotoni emessi è approssimativamente lineare, quindi il rapporto tra l'ricostruito xy fluorescente immagini di mappe spaziali di intensità e lunghezza d'onda corrispondente è anche lineare e calcolato come segue:
dove il valore di m è rappresentata da: 
Nel formalismo di cui sopra, il simbolo λ j rappresenta la lunghezza d'onda delle immagini ° j ricostruita. I valori di λ max e λ ½ vengono estratti dallo spettro di emissione del campione fluoresceina e corrispondono alle lunghezze d'onda in cui l'intensità di fluorescenza del campione fluorescente è al massimo e la metà di massima, rispettivamente. Gli indici immagine j max e j ½ corrispondono alle immagini ricostruite in possesso della massima intensità di fluorescenza e la metà del massimo, rispettivamente.
dove il valore di m è rappresentata da: 
4. La raccolta di dati su campioni biologici di interesse
- Per raccogliere i dati sui vostri campioni, prima rimuovere dal termostato le piastre con colonie di lievito trasformate. Ci dovrebbero essere almeno tre tipi di cellule trasformate a tutta larghezza a metà massimo (FWHM):
- cellule che esprimono le proteine di interesse taggati con entrambi i tipi di sonde fluorescenti
- cellule che esprimono proteine solo taggati con le sonde fluorescenti donatore, e
- cellule che esprimono proteine solo taggati con le sonde fluorescenti accettore.
- Aggiungere 100 ml di 100 mM KCl ad una provetta. Utilizzando una punta micropipetta, raschiare 3-5 colonie di lievito off del piatto di cellule che esprimono proteine taggati con donatore e accettore sonde fluorescenti, e inoculare la mm 100 KCl con queste cellule.
- Rimuovere 10 microlitri della sospensione cellulare ed erogare su un vetrino da microscopio fresco, coprire la goccia con un coprioggetto, e luogo una goccia d'olio sulla superficie del vetrino.
- Chiudere manualmente l'otturatore nel percorso del raggio laser per bloccare la luce laser di raggiungere l'obiettivo microscopio.
- Fissare il vetrino da microscopio alla fase di traduzione xyz e tradurre il vetrino / stage in direzione dell'asse ottico fino a quando l'obiettivo microscopio viene a contatto con la goccia di olio da immersione.
- L'immagine a largo campo del campione sarà severamente offuscata a causa della presenza della griglia di trasmissione nel percorso di emissione. Quindi posto un filtro passa-banda con una FWHM piccolo nel percorso ottico che precedono la griglia di trasmissione. Accendere la luce illuminazione ampio campo e passare alla modalità videocamera della raccolta dei dati. Lentamente tradurre la fase di traduzione in direzione dell'asse ottico l'immagine durante la visualizzazione delle celle sullo schermo della fotocamera fino a quando le cellule vengono messe a fuoco
- Tradurre lo stadio sia la x o la direzione y al fine di portare una singola cella alla posizione del fuoco del raggio laser.
- Spegnere il grande fonte di illuminazione campo. Rimuovere il filtro passa-banda dal percorso di emissione.
- Sblocca il raggio laser per un breve periodo (<1 secondo), visualizzando contemporaneamente il segnale ricevuto al CCD. Se un segnale fluorescente viene rilevato sul CCD durante il tempo del fascio laser è incidente sulla cella, quindi eseguire una scansione completa di fluorescenza di acquisizione dati di questa cella. È fondamentale utilizzare gli stessi parametri di scansione, in particolare il numero di linee e incremento y, come determinato nel caprocedura di librazione dimostrato in precedenza.
- Ripetere la posizione della cella e la fluorescenza di acquisizione dati di processo per un gran numero di cellule che esprimono proteine collegato sia tag donatore e accettore tag.
- Dopo aver accumulato immagini di fluorescenza delle cellule che esprimono proteine taggati con entrambi i recettori, ripetere l'intero processo sia per le cellule che esprimono proteine solo taggati con le sonde fluorescenti donatore e le cellule che esprimono proteine solo taggati con le sonde fluorescenti accettore.
- Utilizzando la procedura descritta nella sezione 3, ricostruire tutte le scansioni di ottenere spettralmente risolte le mappe di intensità fluorescente xy spaziale per ogni set di dati.
5. Analisi delle immagini
Ogni pixel della fluorescenti mappe intensità xy spaziale, che risultano da una singola scansione di una cellula fluorescente biologica, contiene il profilo completo spettrale del complesso molecolare che risiedono nel voxel eccitazione corrispondente a quel particolare pixel. Se le proteine di interesse interagiscono tra loro, questo profilo spettrale conterrà un mix di segnali provenienti sia del donatore e accettore sonde fluorescenti. Al fine di determinare la natura delle interazioni tra le proteine di interesse, i profili spettrali da un gran numero di questi complessi proteina in una cellula deve essere campionato e l'apparente FRET efficienza (e applicazione), definito come la percentuale degli stati eccitati della sonda fluorescente che diventano donatori trasferita alla sonda accettore fluorescente tramite FRET, di ogni pixel deve essere calcolato.
- Determinare i livelli di correzione di intensità di fluorescenza per ciascuna delle immagini ricostruite descritto nella sezione 4 per le cellule che esprimono proteine taggati con donatore solo le sonde fluorescenti e normalizzare al valore massimo. Poiché ognuna di queste immagini ricostruite corrisponde ad una lunghezza d'onda separato (λ j) questa raccolta di valori normalizzati intensità di fluorescenza corrisponde allo spettro di emissione misurati delle sonde donatore, i D (λ j).
- Ripetere il punto 1 per le cellule che esprimono proteine taggati con solo i tag accettore fluorescente per ottenere lo spettro di emissione misurati delle sonde accettore, i A (λ j). Dal momento che la sonda accettore è scelto in modo che raramente è direttamente entusiasta utilizzando la sorgente laser, il segnale proveniente da accettore solo a titolo esemplificativo sarà bassa e probabilmente dello stesso ordine di grandezza del segnale inerente cellule autofluorescenza. Pertanto, lo spettro misurato accettore di fluorescenza calcolato in questo modo può avere bisogno di essere corretti per eliminare il contributo di autofluorescenza prima di procedere.
- Utilizzando lo spettro normalizzato ottenuto al punto 1 e al punto 2, spettralmente scomporre ogni pixel dello spettro di emissione di fluorescenza di cellule che esprimono entrambe le proteine taggati con sonde fluorescenti donatore e proteine taggati con accettore sonde fluorescenti utilizzando la relazione I (λ j) = k DA i D (λ j) + k dC i A (λ j), dove I (λ j) rappresenta ogni pixel misurato particolare spettro di fluorescenza. I valori di k e k DA AD sono proporzionali alla emissione di fluorescenza da parte dei donatori, in presenza di accettori e da accettori in presenza di donatori, rispettivamente 5.
- Calcolare l'apparente efficienza FRET che mappa l'interazione delle proteine nella cellula per ogni pixel utilizzando la formula,
. Qui, Q D e D R sono i rendimenti quantici di sonda fluorescente donatore e accettore sonda fluorescente, rispettivamente, e D w e w A sono gli integrali del donatore normalizzata e l'emissione dello spettro accettore, rispettivamente 19, 20. - Infine, creare un istogramma con i valori calcolati di applicazione e per ogni pixel, in cui viene tracciato il numero di volte che un valore specifico app E si verifica contro quel particolare valore di E app.
. Qui, Q D e D R sono i rendimenti quantici di sonda fluorescente donatore e accettore sonda fluorescente, rispettivamente, e D w e w A sono gli integrali del donatore normalizzata e l'emissione dello spettro accettore, rispettivamente 19, 20. 6. Analisi istogramma
Al fine di estrarre informazioni quantitative dalle app E istogrammi, ogni istogramma è teoricamente in forma con una somma di funzioni gaussiane, secondo la seguente formula: 
,
dove A i è l'ampiezza, i σ la deviazione standard, e 0i E la più probabile FRET efficienza della funzione i-esima gaussiana. Oligomero di diverse dimensionis e configurazioni portare a diversi numeri (n) di 0i E e correlazioni diverse tra loro 1, 17. Per esempio, per un rombo a forma di tetramero, cinque picchi sono previsti, dato da espressioni elencate nella tabella 1.
Relazione Tabella 1. Fra ciascuno dei gaussiana cinque valori di picco e il centro a coppie FRET efficienza previsto per un tetramero a forma di rombo. 
Ciò significa che un solo valore 0i E deve essere regolata nel processo di adattamento dei dati - corrispondente a E p uno - mentre le altre quattro vengono calcolate dal valore di E p.
- Assumere un modello oligomero e identificare il numero di gaussiane da utilizzare nel montaggio E istogrammi applicazione 1. Montare l'istogramma regolando E p, A i e σ i. Si noti che la disposizione relativa degli istogrammi è fissato dal modello. Minimizzare il quadrato chi del fit o qualche altra bontà di adattamento funzionale.
- Assumere un altro modello probabile oligomero e ripetere il passo numero 1.
- Scegli il modello che meglio si adattano i dati per il numero di parametri utilizzati. Che potrebbero richiedere con una prova statistica (come la piazza chi per numero di gradi di libertà).
Rappresentante Risultati
Illustrato nella figura 1 sono la risultante DA k, k dC, ed E le mappe applicazione spaziale calcolata spettralmente risolta a due fotoni microscopia misure eseguite su una cellula di lievito che esprime la sterile 2 α-factor (Ste2p) 21, 22.
Figura 1. Cellula di lievito che esprimono la sterile 2 α-recettore del fattore. Mappe bidimensionali del donatore (k DA) e accettore (k dC) i segnali sono stati ottenuti dalla procedura di deconvoluzione spettrale applicata ad ogni posizione dei pixel delle immagini scattate con la spettralmente risolta a due fotoni microscopio di una cellula di lievito che esprime la sterile 2 α-recettore del fattore (Ste2p). Intensità di fluorescenza sono assegnati falsi colori in base ai loro valori e la scala è indicata come un inserto. Una mappa bidimensionale della apparente tasto efficienze sono state calcolate utilizzando il DA kek immagini dC.
Una trama istogramma è stato preparato utilizzando i valori estratti dalla mappa app E della cellula mostrata in Figura 1. Illustrato nella figura 2 è la trama istogramma montato corrispondenti ai valori misurati E app (cerchi) della cellula illustrato nella figura 1. La linea rossa continua rappresenta la soluzione migliore per i dati misurati utilizzando la somma delle singole funzioni gaussiana (verde linee continue).
Figura 2. Grafico a istogramma dei valori di applicazione e di una cellula di lievito che esprime la sterile 2 α-recettore del fattore. La trama istogramma che corrisponde ai valori misurati (cerchi) di applicazione e per la cella illustrato in Figura 1 è indicata. Singole funzioni gaussiana (solido linee verdi) vengono sommati per simulare (linea continua rossa) i valori misurati. Parametri della funzione gaussiana sono: E 01 = 16,7; A 1 = 118,9; σ 1 = 3.2; E 02 = 25.1; A 2 = 100.0; σ 2 = 4.6; E 03 = 32,6; A 3 = 202,6; σ 3 = 4.6; E 04 = 40,1; A 4 = 92,6; σ 4 = 3.7; E 05 = 50,1; A 5 = 16,0; σ 5 = 7.9.
Le relazioni tra gaussiana mezzi necessari per adattarsi ai dati presentati nel istogramma di Figura 2 sono riportati nella tabella 1. Il numero e la correlazione tra le funzioni gaussiana corrisponde al numero e correlazioni tra i valori attesi e applicazione di complessi tetramero rombo a forma di oligomeri. Pertanto, risulta dalla spettralmente risolta a due fotoni misure che il complesso Ste2p oligomero assume la forma di un tetramero a forma di rombo in vivo 19.
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Discussion
In questa presentazione, abbiamo illustrato come determinare le dimensioni e informazioni strutturali su un complesso proteico oligomeri in vivo. Mentre i dati presentati è stato ottenuto da un recettore di membrana specifico (cioè Ste2p) espressa in cellule di lievito, il metodo è onnicomprensivo, nel senso che può essere applicata a qualsiasi tipo di proteina espressa in qualsiasi tipo di cellula, la unica condizione è che le proteine sono contrassegnati con i marcatori fluorescenti appropriato. Future modifiche a questo protocollo richiede un rafforzamento dello strumento di raggiungere velocità di scansione superiori, nel tentativo di monitorare dipendenti dal tempo dimensioni oligomero proteine e cambia la struttura.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal UW-Milwaukee Research Initiative crescita, l'Istituto Wisconsin e tecnologie biomediche per la salute e la Fondazione Bradley.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | |
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | |
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | |
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | |
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | |
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| Spectrally resolved two photon microscope |
References
- Raicu, V. Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , Springer. London. (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VII, 2007 Jan 1, San Jose, CA, USA , , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
