Summary
Die Eigenblut Injektion Modell der intrazerebralen Blutung bei Mäusen in diesem Protokoll beschriebenen Verwendungen der doppelten Einspritzung Technik, um das Risiko von Blut Reflux bis die Nadel Spur, keine Antikoagulanzien in das Pumpsystem zu minimieren, und eliminiert alle Totraum und erweiterbar Schlauch in das System.
Protocol
1. Vorbereitung der Ausrüstung
- Wischen Sie die stereotaktischen Rahmen und die Pumpe mit 75% Ethanol, um bakterielle Verunreinigungen zu minimieren.
- Sterilisieren Hamilton Spritze und Fused-Silica-Nadel.
Hinweis: Wenn chemische Sterilisation verwendet wird, achten Sie darauf, mehrmals in sterilem Wasser spülen vor Gebrauch. - Wischen Sie die Oberfläche von Paraffinwachs Papier mit 75% Ethanol und trocknen lassen.
2. Vorbereitung der Maus für die Injektion
Hinweis: Haben Mäuse geliefert, Ihr Tier Anlage mindestens 7 Tage vor der Operation, damit sie an die neue Umgebung zu gewöhnen und Stress abzubauen.
- Wiegen Sie mit der Maus für die präoperative Ausgangswert.
- Induce Anästhesie mit 30% Sauerstoff, 70% Lachgas und 4% Isofluran, bis nicht mehr auf Schwanz kneifen
- Inject Maus mit Buprenorphin 0.1mg/kg intraperitoneal zur postoperativen Analgesie
- Shave Kopfhaut
- Coat Augen mit einer sterilen Vaseline
- Bereiten Kopfhaut mit betadine x 3 wischt, dann erlauben Kopfhaut zu trocken
- Machen Sie 1 cm Mittellinie sagittal Schnitt der Kopfhaut mit sterilen chirurgischen Skalpell
Hinweis: Ein großzügiger Schnitt wird vollständige Freilegung des Schädels Sehenswürdigkeiten ermöglichen. - Shave 1 cm von Ventralfläche des Schwanzes ab 1 cm von der Basis und bereiten mit betadine x 3 Tücher
- Bewegen Sie die Maus auf stereotaktischen Rahmen
Hinweis: Es ist wichtig, um sicherzustellen, Maus ist in den Rahmen mit der Oberfläche des Schädels verläuft parallel mit der Basis des Rahmens zu sichern, mit hervorragenden Belichtung Bregma und mindestens 3 mm rechts von Bregma.
3. Intrazerebrale Blutungen Chirurgie
Hinweise: Während der gesamten Operation die Maus narkotisiert mit 30% Sauerstoff, 70% Lachgas und 1-3% Isofluran, kontinuierlich bei 37 ± 0,5 ° C mit einem Thermistor-gesteuerte Heizkissen und überwacht durch rektale Thermometer.
- Bringen Sie sterile 27 g Nadel auf 1 cc Spritze auf dem Rahmen.
- Passen stereotaktischen Arm, bis die Nadel genau über Bregma.
- Passen Sie den Arm so, dass die Nadel ist bei +2,5 mm lateral Bregma und unteren an die Oberfläche des Schädels.
- Manuell drehen Spritze Bohrloch auf der Oberfläche des Schädels zu machen, während leichtem Abwärtsbewegung des Frame-Betreuung nicht vollständig perforieren Schädel.
- Entfernen Sie die Nadel und vollständige Bohrloch manuell mit Spritze / Nadel
Hinweis: Die Vollendung des Bohrloch von Hand ermöglicht die unmittelbare Anerkennung, wenn Sie perforiert die innere Tabelle des Schädels und minimiert das Risiko eines unbeabsichtigten Drücken Nadel in Hirnparenchym haben. - Machen Querinzision am ventralen Schwanz mit sterilen Skalpell und lassen 2-3 große Tropfen des arteriellen Blutes, um auf Paraffin Papier fallen. Dann schnell zu stoppen Blutungen mit Druck mit steriler Gaze.
- Ziehen Sie 17 ul Blut in Hamilton Spritze und Ort Spritze an der Pumpe.
- Passen stereotaktischen Arm Punkt 5 ° nach medial relativ zum vertikalen Achse.
- Sorgfältig stellen stereotaktischen Arm so, dass die Spitze der Nadel ist über das Bohrloch im Schädel und dann untere Nadel 3,5 mm.
- Warten Sie 2 Minuten, dann ziehen Sie die Nadel 0,5 mm (so dass die Spitze ist 3 mm tief)
- 5 Minuten warten, damit das Gehirn um die Nadel wieder zu erweitern und das Risiko zu minimieren Blut siedendem die Nadeleinführung Titel während der Injektion.
- Inject Blut 1 ul / Minute für 7,5 ul.
- 5 Minuten warten, damit anfängliche Blutgerinnung und für das Tissue Verschiebungen auftreten, um Erhebungen in Hirndruck zu minimieren.
- Spritzen Sie die verbleibenden 7,5 l bei 1 ul / Minute
- Lassen Nadel, um im Platz für 25 Minuten bleiben, um für die Blutgerinnung ermöglichen
Hinweis: Die Nichtbeachtung warten für die Blutgerinnung im Blut Rückfluss bis die Nadel Insertionsstelle Ergebnis wird beim Herausziehen der Nadel - Langsam ziehen Sie die Nadel und sofort mit heißem Wasser spülen, um restliche Blut in die Nadel aus Blutgerinnung verhindern und Wiederverwendbarkeit der Nadel.
- Entfernen Sie die Maus aus dem Rahmen und schließen Sie den Schwanz und die Kopfhaut Einschnitte mit veterinärmedizinischen chirurgischen Klebstoff.
- Schalten Sie Anästhesie.
- Lassen Sie die Maus zu wecken, während sie kontinuierlich mit freiem Zugang zu Nahrung befeuchtet erwärmt.
- Zurück Maus Käfig mit Geschwistern, wenn ganz wach. Legen Sie Nassfutter Pellet am Boden des Käfigs, Tiere in den Zugang zu Nahrungsmitteln zu helfen.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Frontalschnitt von Gehirngewebe der Maus 15 Minuten nach ICH Chirurgie. Unmittelbar nach der Tötung des Gehirns für ICH Erfolg auf grobe Inspektion eines koronalen Abschnitt an der Nadel Insertionsstelle beruhte inspiziert. Blutungen, die bis auf die Basis des Gehirns verfolgt, bis die Nadel track Vergangenheit des Corpus Callosum, oder in die Ventrikel wurden als nicht erfolgreich und die Maus wurde aus allen Analysen ausgeschlossen. Insgesamt ICH success lagen 75-85% in 50 Mäuse mit 0% Mortalität.
Abbildung 2. Zylinder Test zeigt links Hemiparese nach rechts Basalganglien ICH. (A) Beispiel Maus hinten nach ICH Chirurgie. Beachten Sie die Platzierung der nur das Recht Vorderbein an der Wand des Zylinders nach links Basalganglien ICH. (B) Graph des Zylinders Test 1 ergibt sich aus Kohorte von Mäusen nach ICH Chirurgie (n = 5) im Vergleich zu den schein (n = 4). Sham-Mäuse hatten alle Verfahren mit Ausnahme von Blut-Injektion (Nadel in Gehirn eingesetzt). Jede Maus wurde in einem 12-cm Durchmesser klare Glaszylinder gelegt und beobachtet seit 20 hinten. Die anfängliche Platzierung der Vorderbeine an der Wand des Zylinders wurde per hinten erzielt. Nachfolgende Bewegungen (z. B. laterale Exploration) wurden nicht gewertet, bis die Maus wieder auf den Boden und die nächste hinten erzielt. Die Lateralität Index wurde berechnet als (# rechte Vorderbein Platzierungen auf der Seite des Zylinders - # linke Vorderbein Platzierungen) / (# rechts + # linke + # beides), wobei 0 zeigten keine forelimb Vorlieben und 1 angegeben nur das Recht forelimb verwendet wurde .
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Discussion
Dieses chirurgische Modell intrazerebralen Blutungen in Mäusen unter Verwendung autologer Schwanzarterie Blutwerte in ein reproduzierbares Modell der spontanen Basalganglien Blutung. Eine ICH-Modell bei Mäusen hat den Vorteil der Verfügbarkeit von transgenen Tieren zu Pathophysiologie untersuchen, jedoch macht ihre geringe Größe neurochirurgische Verfahren technisch schwieriger als in größeren Tieren.
Die Collagenase-Modell und die Eigenblut Injektion Modell sind zwei etablierte Modelle der experimentellen ICH. Während die Kollagenase-Modell bietet eine einfachere Verfahren und eine hohe Reproduzierbarkeit der Blutung 2 konnte das bakterielle Protein verwendet, um die Basalmembran degradieren potenziell Wirkung einer Untersuchung von angeborenen Entzündungsreaktionen. Darüber hinaus Kollagenase-gestört BBB konnte unnatürlich erleichtern Zugang zu Medikamenten, um das Gehirn während der pharmakologischen (zB Neuroprotektion) Experimente. Ein Warfarin-assoziierten ICH Modell hat auch vor kurzem 3 entwickelt, die ermöglicht Untersuchung der Blutung Erweiterung für diese Untergruppe von Patienten. Die Vorteile des Eigenblut Injektion Modell gehören Anwesenheit von mechanischen Beschädigungen mit mass effect verbunden sind, ein steriles System ohne exogene Proteine, die Fähigkeit zur Antikoagulation zu beseitigen, um die natürliche Gerinnung und Entzündung Wege nach spontaner Blutungen zu untersuchen und exquisite Kontrolle über die Größe der Blutung. Da alle Mäuse die gleiche Blutungen Größe haben, können die Effekte von therapeutischen Interventionen auf beiden Gewebe und funktionelle Ergebnis mit Präzision, mit relativ kleinen Stichproben untersucht werden.
Die chirurgische hier beschriebene Vorgehensweise ist ähnlich wie in anderen veröffentlichten Modellen mit Eigenblut Injektion (4-7), und in mehreren Schritten in unserem Protokoll wurden auf diesen veröffentlichten Protokollen. Signifikante Verbesserungen in dieser Technik sind die Beseitigung aller erweiterbar Schläuche und Totraum im System, die potentiell mit genauen Messung des Volumens von Blut injiziert, Beseitigung aller Antikoagulanzien und eine mäßig große Blutung Volumen stören könnten im Vergleich zu anderen Modellen nicht antikoaguliertem Blut. Ein 15 uL ICH in einem durchschnittlich 450 uL erwachsenen Gehirn der Maus für 3% des Hirnvolumens. Dies ist in etwa vergleichbar mit einem 40 mL ICH im Menschen, wird bei normalem durchschnittlichen erwachsenen Gehirn Volumen 1400 ml. Dieses ICH Volumen Ergebnisse in messbaren neurologischen Defizite, die sich über zwei Wochen andauern für das Studium der Erholung und gleichzeitig Null Sterblichkeitsrate, die von praktischer Bedeutung ist bei der Verwendung von teuren transgenen Tieren.
Direkte Visualisierung dieser Operation sollten häufige Fehler und Hilfe in der Mühelosigkeit der Replikation zu beseitigen. Dies wird hoffentlich zu weiteren Erforschung der Mechanismen von Verletzungen übersetzen und beschleunigen die Entwicklung potentieller Therapeutika.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde durch ein Stipendium des Institut for Translational Medicine and Therapeutics, sowie einer Trainings-Zuschuss aus dem Institut für Medizin und Technik (T32HL007954) an der University of Pennsylvania und der Marlene L. Cohen und Jerome H. Fleisch Scholar Grant an der Finanzierung University of Connecticut Health Center (LHS) und NIH NS-029331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
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