Summary
Bu protokolü açıklanan farelerde intraserebral kanama otolog kan enjeksiyonu modeli, iğne izi kadar kan reflü, pompa sistemi hiçbir antikoagülanlar riskini en aza indirmek için çift enjeksiyon tekniği kullanır ve sistemdeki tüm ölü boşluk ve genişletilebilir boru ortadan kaldırır.
Protocol
1. Ekipmanların hazırlanması
- Bakteriyel kontaminasyonu en aza indirmek için,% 75 etanol ile stereotaksik çerçeve ve pompa aşağı doğru silin.
- Hamilton şırınga ve erimiş silika iğne sterilize edin.
Not: Eğer kimyasal sterilizasyon kullanılır, kullanmadan önce steril su ile birkaç kez durulama emin olun. - % 75 etanol ile parafin kağıt yüzeyi silin ve kurumasını bekleyin.
2. Enjeksiyon için fare hazırlanması
Not: fareler var, onlara yeni bir çevre gelmesini ve stresi azaltmak için izin hayvan tesis ameliyattan önce en az 7 gün teslim.
- Ameliyat öncesi bazal için fare tartılır.
- Tepkisiz kadar kuyruk tutam İsofluranın% 30 Oksijen,% 70 oksit ve% 4 ile anestezi neden
- Post-operatif analjezi için buprenorfin 0.1mg/kg intraperitoneal fare enjekte
- Kafa derisi Tıraş
- Steril vazelin ile Coat gözleri
- Betadin x 3 mendil ile kafa derisi hazırlayın, sonra kafa derisi kurumasını bekleyin
- Kafa derisi steril cerrahi neşter kullanılarak 1 cm orta hat sagittal kesi
Not: cömert bir kesi kafatası yerlerinden tam maruz sağlayacaktır. - Tabanından başlayan kuyruk 1 cm ventral yüzeyinin 1 cm Tıraş ve betadin x 3 mendil hazırlamak
- Stereotaksik çerçeve yerleştirin fare
Not: fare mükemmel bregma bregma sağ kalma ve en az 3 mm, çerçeve tabanı ile kafatası paralel yüzeyi ile çerçeve güvenli sağlamak için önemlidir.
3. Intraserebral kanama ameliyatı
Notlar: tüm ameliyat boyunca sürekli 37 muhafaza İsofluranın% 30 Oksijen,% 70 oksit ve% 1-3, fare ile anestezi ± 0.5 ° C termistör kontrollü ısıtma yastığı ve rektal termometre ile izlenir.
- 1 cc şırınga çerçeve üzerinde steril 27 g iğne takın.
- Stereotaksik kol tam bregma yerinde iğne kadar ayarlayın.
- Bu iğne 2,5 mm kafatası yüzeyine bregma lateral ve alt böylece kol ayarlayın.
- El tamamen kafatası delinecek çerçeve dikkate alarak hafif aşağı yönlü hareketi uygularken kafatası yüzeyinde burr hole şırınga döndürün.
- Şırınga / iğne ile iğne ve tam burr hole elle çıkarın
Not: Eğer kafatası ve beyin parankimi içine iğne yanlışlıkla itme riski en aza indirir iç tablo delikli varken el ile burr hole tamamlanması hemen tanınması için izin verir. - , Steril cerrahi bıçak kullanarak kuyruk ventral yüzeyinde enine kesi yapın ve arteryel kan 2-3 büyük damla parafin kağıt üzerine düşmesine izin. Sonra hızlı bir şekilde steril gazlı bez kullanarak basıncı ile kanamayı durdurmak.
- 17 mcL kan Hamilton enjektör ve pompa üzerinde yer şırınga içine çekin.
- Point 5 stereotaksik kol ayarlayın ° dikey eksen mediale göreceli.
- Bu iğne ucu kafatasında burr hole üzerinde ve daha sonra alt iğne 3,5 mm kadar dikkatle stereotaksik kol ayarlayın.
- 2 dakika sonra 0.5 mm iğne geri bekleyin (böylece ucu derin 3 mm)
- Beyin iğne etrafında yeniden genişletmek ve enjeksiyon sırasında iğne ekleme parça geri kaçmasını kan riskini en aza indirmek için 5 dakika bekleyin.
- 7.5 mcL kan 1 mcL / dakika enjekte edilir.
- Ilk kan pıhtılaşması izin ve doku vardiya, intrakranial basıncı yükselmeleri en aza indirmek için meydana 5 dakika bekleyin.
- 1 mcL / dakika kalan 7.5 mcL enjekte
- Iğne, kan pıhtılaşması için izin vermek için 25 dakika boyunca yerinde kalması için izin verin
Not: Başarısızlık, kan pıhtılaşması, kan iğne ekleme sitesi reflüye neden olacaktır iğne çekilirken beklemek - Yavaş yavaş geri çekilmesi ve iğne iğne herhangi bir kalıntı kan pıhtılaşma önlemek ve iğne tekrar kullanılabilirliği sağlamak için derhal sıcak su ile durulayın.
- Çerçeveden çıkarın ve fareyi, veteriner cerrahi yapıştırıcı ile kuyruk ve kafa derisi kesiler yakın.
- Anestezi kapalı açın.
- Sürekli gıda nemlendirilmiş için ücretsiz erişim ile ısındı olurken uyandırmak için fare izin verin.
- Littermates tamamen uyanık kafes fare dönün. Gıdaya erişim hayvanlara yardım etmek için kafesin altındaki ıslak gıda pelet yerleştirin.
4. Temsilcisi sonuçları:
Şekil 1. Koronal bölümünde, 15 dakika ICH cerrahi sonra fare beyin . Hemen sonra kurban beyin iğne ekleme yerinde bir koronal bölümünde brüt muayene dayalı ICH başarısı için denetlendi. Korpus kallosum geçmiş, ya da ventriküller içine iğne izi kadar, beyin tabanına paletli kanamalar başarısız sayılır ve o fare tüm analizler elendi. Genel ICH success oranları% 0 mortalite ile 50 farelerde% 75-85 idi.
Şekil 2 Silindir test sağ bazal ganglion ICH sonra sol hemiparezi göstermektedir. ICH cerrahi sonrası (A) Örnek fare arkada. Sadece sağ ön ayakları, sonra sol bazal ganglion ICH silindir duvara yerleştirilmesi unutmayın. (B) silindir test grafiği sonra farelerin kohortta 1 sonuç ICH cerrahi (n = 5) sahte karşılaştırıldığında (n = 4). Şam farelerin kan enjeksiyon (iğne beyin içine yerleştirilmiş) dışındaki tüm prosedürler vardı. Her fare, 12 cm çapında açık cam silindir yerleştirilir ve 20 rears gözlendi. Silindir duvara ön ayakları ilk yerleşim arka ortalama gol oldu. Fare yere geri döndü ve sonraki arka puan kadar daha sonraki hareketleri (yanal arama gibi) gol değildi. 0 hiçbir ön ayakları tercihi ve 1 sadece sağ ön ayakları nerede, (# + # sağ sol + # iki) / - lateralite indeksi olarak hesaplanır (silindir tarafında # # ön ayakları yerleşimleri sol sağ ön ayakları yerleşimleri) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intraserebral kanama, spontan bazal ganglia kanama tekrarlanabilir bir model otolog kuyruk arter kan sonuçlarını kullanarak farelerde Bu cerrahi modeli. Farelerde bir ICH modeli patofizyolojisi araştırmak amacıyla transgenik hayvanların durumu avantaj sunar; Ancak, bunların küçük boyutlu büyük hayvanların daha nöroşirürjikal işlemler teknik açıdan daha zor hale getirir.
Kollajenaz model ve otolog kan enjeksiyonu modeli deneysel ICH iki köklü modelleri. Kollajenaz modeli daha kolay bir prosedür ve yüksek tekrarlanabilir bir kanama 2 sunarken, bazal membran aşağılamak için kullanılan bakteriyel protein potansiyel, doğuştan gelen inflamatuvar yanıtların herhangi bir soruşturma etkisi olabilir. Buna ek olarak, BBB doğal olmayan, farmakolojik (örneğin, nöro-) deneyler sırasında beyin ilaç erişimi kolaylaştırmak kollajenaz-bozulur. Warfarin ile ilişkili ICH modeli yakın zamanda hastaların bu alt kanama genişleme soruşturma sağlar, 3 geliştirilen olmuştur. Otolog kan enjeksiyonu modeli faydaları, kitle etkisi ile ilişkili mekanik hasar, dış kaynaklı proteinler olmadan steril bir sistem, doğal koagülasyon ve inflamasyon yollar kendiliğinden kanama sonra araştırmak için antikoagülasyon ortadan kaldırmak için yeteneği ve boyutu üzerinde nefis kontrol varlığı kanama. Tüm fareler aynı kanama boyutu olduğundan, doku ve fonksiyonel sonuçlar hem terapötik müdahalelerin etkileri nispeten küçük bir örneklem büyüklüğü ile hassasiyet ile incelenebilir.
Burada açıklanan cerrahi prosedür otolog kan enjeksiyonu (4-7) kullanılarak yayınlanan diğer modelleri benzer ve protokolde birkaç adım yayınlanan bu protokolleri dayanıyordu. Bu teknikte önemli iyileştirmeler potansiyel olmayan diğer modellere göre kan enjekte antikoagülanların ortadan kaldırılması ve bir orta büyük kanama hacmi hacim doğru ölçümü etkileyebilecek sistemdeki tüm körüklü boru ve ölü boşluğun ortadan kaldırılması, antikoagüle kan. Beyin hacminin% 3 ortalama 450 uL yetişkin farenin beyin hesapları 15 uL ICH. Bu adam 40 ml ICH kabaca karşılaştırılabilir varsayarak, normal ortalama yetişkin beyin hacmi 1400 ml. Bu ICH hacmi sonuçları pahalı transgenik hayvanlar kullanarak pratik önemi sıfır ölüm oranı korurken, kurtarma çalışması için iki hafta boyunca devam ölçülebilir nörolojik defisit.
Bu ameliyatı Doğrudan görselleştirme çoğaltma kolaylığı, sık yapılan hataları ve yardım ortadan kaldırmak gerekir. Umarım bu yaralanma mekanizmaları içine daha fazla araştırma çevirmek ve potansiyel terapötikler gelişimini hızlandıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu iş, Translasyonel Tıp ve Tedavi Enstitüsü dostluk ve Pennsylvania Üniversitesi ve Marlene L. Cohen ve Jerome H. Fleisch Scholar Grant, Tıp ve Mühendislik (T32HL007954) Enstitüsü eğitim bursu tarafından finanse edildi Connecticut Üniversitesi Sağlık Merkezi (LHS) ve NIH NS-029.331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
