Summary
Den autologt blod injektion modell av intracerebral blödning hos möss som beskrivs i detta protokoll använder sig av dubbla injektionstekniken för att minimera risken för att blod reflux upp nålen spåret, ingen antikoagulantia i pumpsystem, och eliminerar alla döda utrymme och utbyggbar slang i systemet.
Protocol
1. Förberedelse av utrustning
- Torka av stereotaxic ramen och pumpen med 75% etanol för att minimera bakteriell kontamination.
- Sterilisera Hamilton spruta och kvarts nål.
Obs: Om kemisk sterilisering används, se till att spola flera gånger i sterilt vatten före användning. - Torka ytan av paraffin papper med 75% etanol och låt torka.
2. Beredning av musen för injektion
OBS: Har möss levereras till ditt djur anläggningen minst 7 dagar före operation för att tillåta dem att anpassa sig till den nya miljön och minska stress.
- Väg musen för preoperativ baslinjen.
- Inducera anestesi med 30% syre, 70% dikväveoxid, och 4% isofluran tills svarar på svansen nypa
- Injicera mus med buprenorfin 0.1mg/kg intraperitonealt för postoperativ smärtlindring
- Raka hårbotten
- Coat ögonen med sterilt vaselin
- Förbered hårbotten med Betadine x 3 våtservetter, sedan låta hårbotten torka
- Gör 1 cm mittlinje sagittala snitt i hårbotten med hjälp av sterila kirurgiska skalpell
OBS: En generös snitt kommer att tillåta fullständig exponering av skallen landmärken. - Shave 1 cm ventrala yta svans börjar den 1 cm från botten och förbereda med Betadine x 3 servetter
- Placera musen på stereotaxic ram
OBS: Det är viktigt att se till musen är säker i ramen med ytan av skallen parallellt med basen av ramen, med utmärkt exponering av bregma och minst 3 mm till höger om bregma.
3. Intracerebral blödning operation
Anteckningar: Under hela operationen musen är bedövas med 30% syre, 70% dikväveoxid, och 1-3% isofluran, kontinuerligt vid 37 ± 0,5 ° C med en termistor kontrollerad värmedyna och övervakas av rektal termometer.
- Fäst steril 27 G-nål på 1 cc spruta på ram.
- Justera stereotaxic armen tills nålen är precis över bregma.
- Justera armen så att nålen är på 2,5 mm lateralt bregma och lägre på ytan av skallen.
- Manuellt rotera sprutan så att burr hål på ytan av skallen samtidigt som mjuka nedåtgående rörelse av ram-noga med att inte helt perforera skallen.
- Ta bort nålen och komplett Burr hål manuellt med spruta / nål
Obs: Slutföra burr hålet för hand gör det möjligt att omedelbart erkännande när du har perforerade inre tabellen över skallen och minimerar risken för misstag trycka in nålen i hjärnparenkymet. - Gör tvärgående snitt på ventrala yta av svansen med hjälp av sterila kirurgiska blad och låt 2-3 stora droppar arteriellt blod falla på paraffin papper. Sedan snabbt stoppa blödningen med tryck med steril gasbinda.
- Uttag 17 mikroliter blod i Hamilton sprutan och placera sprutan på pumpen.
- Justera stereotaxic arm till punkt 5 ° medialt i förhållande till vertikal axel.
- Justera noggrant stereotaxic armen så att nålspetsen är över Burr hål i skallen och sedan sänka nål 3,5 mm.
- Vänta 2 minuter sedan ut nålen 0,5 mm (så att spetsen är 3 mm djup)
- Vänta 5 minuter så att hjärnan att åter expandera runt nålen och minimera risken för att blod refluxing upp spåret nålen insättning under injektion.
- Injicera blodet 1 ml / minut för 7,5 mikroliter.
- Vänta 5 minuter så att första blodproppar och för mjukpapper skift att inträffa för att minimera förhöjt intrakraniellt tryck.
- Injicera resterande 7,5 mikroliter vid 1 ml / minut
- Låt nålen sitta kvar i 25 minuter så att för blodproppar
OBS: Om du inte vänta på blodkoagulering kommer att resultera i blodet refluxing upp webbplatsen nålen insättning när nålen dras ut - Långsamt ut kanylen och skölj omedelbart med varmt vatten för att förhindra eventuella kvarstående blod i nålen levrar och säkerställa återanvändning av nålen.
- Ta bort musen från ramen och stäng svans och snitt hårbotten med veterinär kirurgiskt lim.
- Stäng av anestesi.
- Låt musen för att väcka samtidigt som kontinuerligt värmas med fri tillgång till fuktad mat.
- Återgå mus bur med syskon när de är fullt vaken. Placera våtfoder pellet på botten av buren för att hjälpa djur i tillgång till mat.
4. Representativa resultat:
Figur 1. Koronalt avsnitt av musen hjärnan 15 minuter efter ICH operationen. Omedelbart efter offer hjärnan inspekterades för ICH framgång bygger på grov inspektion av en coronal avdelning på nålen insticksstället. Blödningar som spåras ner till basen av hjärnan, upp nålen spåret förbi corpus callosum, eller i ventriklarna bedömdes misslyckade och att musen blev utslagen från samtliga analyser. Totalt ICH Succéss priserna var 75-85% i 50 möss med 0% dödlighet.
Figur 2. Cylinder test visar vänster hemipares efter rätt basala ganglierna ICH. (A) Exempel på mus bak efter ICH operation. Notera placeringen av endast rätten forelimb på väggen av cylindern efter vänstra basala ganglierna ICH. (B) Diagram av cylinder testa ett resultat från kohort av möss efter ICH kirurgi (n = 5) jämfört med simulerad injektion (n = 4). Sham möss hade alla förfaranden utom blod-injektion (nål infördes i hjärnan). Varje mus placerades i en 12-cm diameter klar glasampull och noterats för 20 föder upp. Den ursprungliga placeringen av frambenen på väggen av cylindern var poäng per bak. Efterföljande rörelser (t ex lateral prospektering) inte gjorde förrän musen tillbaka till marken och nästa bakre poäng. Den Laterality index beräknas som (# höger forelimb placeringar på sidan av cylindern - # vänster forelimb placeringar) / (# höger + # vänster + # båda), där 0 angav ingen forelimb önskemål och 1 anges endast rätt forelimb användes .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna kirurgiska modell av intracerebral blödning i möss med autologt svans resultat artär blod på ett reproducerbart modell av spontana basala ganglierna blödning. En ICH modell i möss erbjuder fördelen av tillgången av transgena djur för att undersöka patofysiologi, men gör deras ringa storlek neurokirurgiska ingrepp tekniskt svårare än i större djur.
Den kollagenas modellen och autologt injektionen modellen är två väletablerade modeller av experimentell ICH. Medan kollagenas modellen erbjuder ett enklare förfarande och en mycket reproducerbar blödning 2, kan den bakteriella protein som används för att försämra basalmembranet effekten potentiellt utredningar av medfödda inflammatoriska reaktioner. Dessutom kollagenas-störde BBB onaturligt skulle kunna underlätta drog tillgång till hjärnan under farmakologiska (t.ex. neuroprotektion) experiment. En warfarin-associerad ICH-modellen har också nyligen tagits fram 3, som tillåter utredning av blödningar expansion för denna undergrupp av patienter. Fördelarna med autologt injektionen modellen inkluderar förekomsten av mekaniska skador i samband med Mass Effect, ett sterilt system utan exogena proteiner, förmågan att eliminera antikoagulation för att undersöka den naturliga koagulation och vägar inflammation efter spontana blödningar, och utsökt kontroll över storleken av blödning. Eftersom alla möss har samma blödning storlek, kan effekterna av terapeutiska åtgärder på både mjukpapper och funktionella utfallet studeras med precision med relativt små urvalsstorlekar.
Det kirurgiska ingreppet beskrivs här liknar andra publicerade modeller med hjälp av autologt blod injektion (4-7), och flera steg i våra protokoll baserades på dessa publicerade protokoll. Betydande förbättringar av den här tekniken inkluderar avskaffande av alla utbyggbart slangar och Dead Space i systemet, vilket potentiellt kan störa exakt mätning av volymen av blod injiceras, avskaffande av alla antikoagulantia, och en måttligt stor blödning volym jämfört med andra modeller av icke -antikoagulerat blod. En 15 uL ICH i genomsnitt 450 uL hjärnan vuxen mus står för 3% av hjärnans volym. Detta är jämförbart med en 40 ml ICH i människan, är en normal genomsnittlig vuxen hjärna volym 1400 ml. Detta ICH volym resulterar i mätbara neurologiska bortfall som kvarstår under två veckor för studier av återhämtning samtidigt som noll dödlighet, som är av praktisk betydelse när man använder dyra transgena djur.
Direkt visning av denna kirurgi bör eliminera vanliga misstag och stöd i enkel replikering. Förhoppningsvis kommer detta att översätta till ytterligare undersökningar av mekanismerna för skada och påskynda utvecklingen av potentiella läkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet har finansierats av ett stipendium från Institutet för translationell medicin och terapier, och ett utbildningsstipendium från Institutet för medicin och teknik (T32HL007954) vid University of Pennsylvania och Marlene L. Cohen och Jerome H. Fleisch Scholar Grant vid University of Connecticut Health Center (LHS) och NIH NS-029.331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
- Rynkowski, M. A., Kim, G. H., Komotar, R. J., Otten, M. L., Ducruet, A. F., Zacharia, B. E., Kellner, C. P., Hahn, D. K., Merkow, M. B., Garrett, M. C. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nat. Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Doré, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- Zhao, X., Sun, G., Zhang, J., Strong, R., Song, W., Gonzales, N., Grotta, J. C., Aronowski, J. Hematoma resolution as a target for intracerebral hemorrhage treatment: Role for peroxisome proliferator-activated receptor γ in microglia/macrophages. Annals of Neurology. 61, 352-362 (2007).
