Summary
이 프로토콜에서 설명하는 생쥐에서 했습니다만 출혈의 autologous 혈액 주입 모델은 바늘 트랙까지 혈액 역류, 펌핑 시스템에서 anticoagulants의 위험을 최소화하기 위해 이중 사출 기술을 사용하고, 시스템의 모든 죽은 공간 및 확장 튜브를 제거합니다.
Protocol
1. 장비 준비
- 박테리아 오염을 최소화하기 위해 75 % 에탄올로 stereotaxic 프레임과 펌프를 아래로 닦아주십시오.
- 해밀턴 주사기와 융합된 실리카 바늘을 소독.
참고 : 화학 살균을 사용하면, 사용하기 전에 멸균 물에 여러 번 씻어해야합니다. - 75 % 에탄올로 파라핀 왁스 종이의 표면을 닦아 건조 수 있습니다.
2. 분사에 대한 마우스의 준비
참고 : 그들이 새로운 환경에 적응하고 스트레스를 줄일 수 있도록 귀하의 동물 시설에 대한 수술 전 최소 7 일 전달 생쥐 되세요.
- 사전 수술 기본에 대한 마우스의 무게를.
- 꼬리 핀치에 응답하기 전까지 Isoflurane 30 % 산소 70 % 질소 산화물, 4 %를 마취를 유발
- 이후 수술 진통제에 대한 buprenorphine 0.1mg/kg intraperitoneally와 마우스를 주사
- 두피를 쉐이브
- 무균 석유 젤리로 코트의 눈
- betadine × 3 잎사귀와 두피를 준비 후, 두피가 건조 수
- 멸균 수술 메스를 사용하여 두피의 1cm 절개 정중선 화살 만들기
참고 : 관대한 절개는 두개골의 랜드마크의 완전한 노출을 수 있습니다. - 베이스에서 1cm를 시작 꼬리 복부 표면의 1cm를 면도하고 betadine와 × 3 잎사귀 준비
- stereotaxic 프레임에 마우스 플레이스
참고 : 마우스 bregma의 오른쪽에있는 우수 bregma의 노출과 최소 3mm와 프레임의 기본과 두개골 병렬의 표면과 프레임에 안전하게하는 것이 중요합니다.
3. 했습니다만 출혈 수술
참고 : 전체 수술하는 동안 마우스를 지속적으로 37 유지 Isoflurane 30 % 산소 70 % 질소 산화물, 그리고 1-3%와 anesthetized있다 ± 0.5 ° C는 서미 스터 제어 가열 패드를 사용하고 직장 온도계에 의해 감시.
- 프레임 1 CC의 주사기에 살균 27g 바늘을 연결합니다.
- 바늘 정확히 bregma 끝날 때까지 stereotaxic 팔을 조정합니다.
- 그 바늘은 두개골의 표면에 bregma에 수평 낮은 2.5 mm에서되도록 팔을 조정합니다.
- 수동으로 완전히 두개골을 구멍하지 프레임 복용 치료의 완만한 하향 운동을 적용하는 동안 머리의 표면에 버 구멍을 만들기 위해 주사기를 회전.
- 주사기 / 바늘로 수동으로 바늘하고 완전한 버 구멍을 제거
참고 : 두개골과 뇌 실질 실수로 바늘을 밀어의 최소화 위험의 내부 테이블을 천공이있을 때 손으로 버 구멍을 완료하면 즉시 인식을 허용합니다. - 멸균 수술 블레이드를 사용하여 꼬리의 복부 표면에 가로 절개를하고 동맥혈로부터 2-3 큰 방울은 파라핀 왁스 종이에 떨어질 수 있습니다. 다음 신속하게 멸균 거즈를 사용하여 압력과 출혈 중지합니다.
- 펌프에 해밀턴 주사기 및 장소 주사기에 17 μL 혈액을 철회.
- 포인트 5 stereotaxic 팔을 조정 ° 수직 축에 상대 medially.
- 바늘의 끝은 두개골에 버 구멍을 통해 그리고 낮은 바늘 3.5 mm가되도록 조심스럽게 stereotaxic 팔을 조정합니다.
- 2 분 후 바늘 0.5 mm를 철회 잠깐 만요, (그래서 끝을 깊이 3mm입니다)
- 두뇌가 바늘 주위에 다시 확장하고 주입하는 동안 바늘 삽입 트랙을 refluxing 혈액의 위험을 최소화할 수 있도록 5 분 동안 기다리십시오.
- 7.5 μL를위한 혈액 1 μL / 분 주사.
- 초기 혈액 응고 허용하고 조직 교대에 대한 intracranial 압력 고도를 최소화하기 위해 발생하는 5 분 동안 기다리십시오.
- 1 μL / 분에 남아있는 7.5 μL를 주입
- 바늘이 응고 혈액 수 있도록 25 분 장소에서 유지하도록 허용
참고 : 응고 혈액은 바늘을 삽입 사이트를 refluxing 혈액집니다 위해 바늘을 철수 때 기다려야 실패 - 천천히 주사기를 철회하고 응고에서 바늘에 잔류 혈액을 방지하고 바늘의 재사용을 보장하기 위해 즉시 온수 헹굼.
- 프레임에서 마우스를 제거하고 수의학 수술 접착제와 꼬리와 두피 incisions를 닫습니다.
- 마취의 전원을 끕니다.
- 지속적으로 음식을 moistened을 무료로 이용 예열되는 동안 학살 마우스 수 있습니다.
- littermates 때 완전히 깨어와 케이지에 마우스를 반환합니다. 음식에 대한 액세스 동물 도움 새장 바닥에 서부 유럽 표준시 음식 펠릿를 놓습니다.
4. 대표 결과 :
그림 1. 십오분 ICH 수술 후 마우스 뇌 코로나 섹션을 참조하십시오. 즉시 두뇌가 바늘을 삽입 사이트에서 코로나 섹션의 총 점검에 따라 ICH의 성공을위한 검사되었습니다 희생. 코퍼스의 callosum 과거, 또는 심실에 바늘 트랙까지, 두뇌의 기본까지 추적 출혈이 실패한 것으로 간주되었고 그 생쥐는 모든 분석에서 제거되었습니다. 전체 ICH succeSS 요금은 0 % 사망률과 함께 50 생쥐에 75~85%되었습니다.
그림 2. 실린더 시험 바로 기저 신경의 ICH 후 왼쪽 hemiparesis을 보여줍니다. ICH 수술 후 (A) 샘플 마우스 후면. 왼쪽 기초 신경의 ICH 후 실린더의 벽에에서만 오른쪽 forelimb의 위치를 적어 둡니다. (B) 실린더 테스트 그래프 후 마우스 일대에서 1 결과 ICH 수술 (N = 5) 가짜에 비해 (n은 = 4). 위장 마우스는 혈액 주입 (바늘이 두뇌에 삽입되었다)를 제외한 모든 절차를했다. 각 마우스는 12 cm 직경 투명 유리 실린더에 배치 20 투우사에 대한 관찰되었다. 실린더의 벽면에있는 앞발의 초기 배치는 후면마다 득점했다. 마우스 바닥에 반환하고 다음 뒤쪽가 득점하기 전까지 후속 움직임은 (예 : 수평 탐사 등) 득점되지 않았습니다. 0 더 forelimb 선호 1은 오른쪽 forelimb가 사용되었습니다 표시하지 표시된 곳에, (# 오른쪽 + # 왼쪽 + # 모두) / - laterality 지수는 계산 (# forelimb 게재 위치 왼쪽 실린더의 측면에 # 오른쪽 forelimb 위치)가 .
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Discussion
자연 기초 신경의 출혈을 재현할 모델 autologous 꼬리 동맥 혈액 검사 결과를 사용하여 생쥐에서 했습니다만 출혈이 수술 모델입니다. 생쥐의 ICH 모델은 pathophysiology을 조사하기 위해 유전자 변형 동물의 이용의 장점을 제공하지만, 그들의 작은 크기가 큰 동물에 비해 neurosurgical 절차가 더 기술적으로 어려울 수 있습니다.
collagenase 모델과 autologous 혈액 주입 모델은 실험 ICH 두 개의 잘 구축 모델입니다. collagenase 모델 쉽게 절차와 높은 재현성 출혈이 제공하는 동안, 지하 막이 저하될하는 데 사용되는 박테리아 단백질은 잠재적으로 타고난 염증 반응의 조사에 영향을 수 있습니다. 또한, BBB가 비정상적으로 약리 (예, neuroprotection) 실험을하는 동안 두뇌에 약물 액세스를 용이하게 수 collagenase은 - 중단. warfarin - 관련 ICH 모델은 최근 환자의 하위 집합에 대한 출혈 확장의 조사를 허용하는, 3 개발되었습니다. autologous 혈액 주입 모델의 장점은 대량 효과와 관련된 기계적 손상, 외인성 단백질이없는 무균 시스템, 자발적인 출혈 후 자연 응고와 염증 경로를 조사하기 위해 anticoagulation을 제거하는 능력, 그리고 크기를 초과하는 절묘한 컨트롤의 존재를 포함 뇌출혈의. 모든 생쥐 같은 뇌출혈 크기 때문에, 조직 및 기능 결과 모두에서 치료 개입의 효과는 상대적으로 작은 샘플 크기와 정확하게 공부하실 수 있습니다.
여기에서 설명한 수술은 autologous 혈액 주입 (4-7)를 사용하여 다른 출판 모델과 유사합니다, 그리고 프로토콜의 여러 단계는이 프로토콜을 기반으로 게시되었습니다. 이 기법을 크게 개선 가능성이 아닌 다른 모델에 비해 혈액 주입, 모든 anticoagulants의 제거, 그리고 적당히 큰 출혈 볼륨의 볼륨의 정확한 측정에 영향을 줄 수 시스템의 모든 확장 튜브와 죽은 공간의 제거를 포함 - anticoagulated 혈액. 뇌 용적의 3 %에 대해 평균 450 UL 성인 마우스 뇌 계정에 15 UL의 ICH. 이것은 남자의 40 ML의 ICH에 대략 비교, 가정 일반 평균 성인 뇌 용적 1400 ML입니다. 비싼 유전자 변형 동물을 사용하는 경우에는 실질적인 중요 제로 사망률을 유지하면서 회복의 연구를위한 2 주 동안 계속 측정 신경 결손이 ICH 볼륨 결과.
이 수술의 직접 시각화는 복제의 용이성으로 일반적인 실수 및 지원을 제거합니다. 바라건대이 부상의 메커니즘에 대한 조사로 번역하고 잠재적인 치료제의 개발을 촉진합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
작품은 Translational 의학 및 치료학에 대한 연구소의 화목과에서 펜실베니아 대학과 마를린 L. 코헨과 제롬 H. Fleisch 학술 그랜트 의학 및 공학 (T32HL007954)의 연구소에서 교육 교부금에 의해 투자되었다 코네티컷 대학 보건 센터 (LHS)와 NIH NS - 029331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
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- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
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