Summary
O modelo de injeção de sangue autólogo de hemorragia intracerebral em camundongos descritos neste protocolo usa a técnica de injecção dupla para minimizar o risco de refluxo de sangue até a faixa de agulha, não anticoagulantes no sistema de bombeamento, e elimina todo o espaço morto e tubos expansíveis no sistema.
Protocol
1. Preparação de equipamentos
- Limpe o quadro estereotáxico e bomba com etanol 75% para minimizar a contaminação bacteriana.
- Esterilizar Hamilton seringa e agulha de sílica fundida.
Nota: Se esterilização química é usado, não se esqueça de lavar várias vezes em água estéril antes do uso. - Limpe a superfície do papel de cera de parafina com etanol 75% e deixar secar.
2. Preparação de mouse para injeção
Nota: Tenha ratos entregues à sua facilidade de animais pelo menos 7 dias antes da cirurgia, que lhes permitam adaptar ao novo ambiente e reduzir o estresse.
- Pesar do mouse para linha de base pré-operatório.
- Induzir a anestesia com oxigênio a 30%, 70% de óxido nitroso e isoflurano até 4% que não respondem a pitada de cauda
- Injetar mouse com buprenorfina por via intraperitoneal 0.1mg/Kg para analgesia pós-operatória
- Raspar couro cabeludo
- Olhos casaco com vaselina estéril
- Prepare couro cabeludo com betadine x 3 wipes, em seguida, permitir couro cabeludo para secar
- Faça um centímetro incisão mediana sagital do couro cabeludo com bisturi cirúrgico estéril
Nota: A incisão generosa irá permitir a exposição completa de marcos crânio. - Shave um centímetro da superfície ventral da cauda com início em 1 cm da base e preparar com betadine x 3 wipes
- Rato lugar no quadro estereotáxico
Nota: É importante assegurar mouse está seguro no quadro com a superfície do crânio paralelo com a base do quadro, com excelente exposição do bregma e pelo menos 3 mm à direita do bregma.
3. Cirurgia hemorragia intracerebral
Notas: Durante toda a cirurgia o mouse é anestesiado com oxigênio a 30%, 70% de óxido nitroso, e 1-3% do isoflurano, foi mantido a 37 ± 0,5 ° C usando um termistor-almofada de aquecimento controlado e monitorado por termômetro retal.
- Anexar estéril 27 g em 1 agulha de seringa cc no frame.
- Ajuste o braço estereotáxico até agulha é exatamente sobre bregma.
- Ajuste o braço de modo que a agulha é 2,5 milímetros lateral ao bregma e inferiores para a superfície do crânio.
- Manualmente girar seringa para fazer orifício de trepanação na superfície do crânio ao aplicar movimento descendente suave do quadro de tomada de cuidado para não perfurar o crânio completamente.
- Remova a agulha e orifício de trepanação completa manualmente com seringa / agulha
Nota: Completando o orifício de trepanação à mão permite o reconhecimento imediato quando tiver perfurado a tabela interna do crânio e minimiza o risco de, inadvertidamente, empurrando agulha no parênquima cerebral. - Fazer incisão transversal na superfície ventral da cauda utilizando lâmina cirúrgica estéril e permitir 2-3 gotas grandes de sangue arterial a cair sobre o papel de cera de parafina. Em seguida, rapidamente parar o sangramento com pressão usando gaze estéril.
- Retirar 17 mL de sangue em seringa e seringa Hamilton lugar na bomba.
- Ajuste o braço estereotáxico para apontar 5 ° medialmente em relação ao eixo vertical.
- Ajustar cuidadosamente o braço estereotáxico de forma que a ponta da agulha está sobre o orifício de trepanação no crânio e abaixe agulha de 3,5 mm.
- Aguarde 2 minutos, em seguida retire a agulha 0,5 mm (de modo que a ponta é de 3 mm de profundidade)
- Espere 5 minutos para permitir que o cérebro re-expansão ao redor da agulha e minimizar o risco de refluxo de sangue até a faixa de inserção da agulha durante a injeção.
- Injetar mL de sangue 1 / minuto para 7,5 mL.
- Espere 5 minutos para permitir que o sangue inicial de coagulação e de mudanças do tecido ocorrer para minimizar a elevação da pressão intracraniana.
- Injetar a 7,5 mL restantes de 1 mL / minuto
- Permitir agulha para permanecer no local por 25 minutos para permitir a coagulação do sangue
Nota: Não esperar até que a coagulação do sangue irá resultar em refluxo de sangue até o local de inserção de agulha para retirar a agulha - Lentamente, retirar a agulha e lave imediatamente com água quente para evitar qualquer sangue residual na agulha de coagulação e garantir a reutilização da agulha.
- Remova o mouse a partir do quadro e fechar o rabo e incisões no couro cabeludo com cola cirúrgica veterinária.
- Desligue a anestesia.
- Permitem mouse para despertar ao ser aquecido continuamente com acesso gratuito à umedecido alimentos.
- Retorno do mouse para gaiola com littermates quando totalmente acordado. Lugar úmido alimentos pelota no fundo da gaiola para ajudar os animais no acesso aos alimentos.
4. Resultados representativos:
Figura 1. Secção coronal do cérebro do rato 15 minutos após a cirurgia ICH. Imediatamente após o sacrifício do cérebro foi inspecionado por ICH sucesso com base na inspeção bruta de uma seção coronal no local de inserção da agulha. Hemorragias que rastreou até a base do cérebro, a pista agulha após o corpo caloso, ou para os ventrículos foram consideradas mal sucedidas e que o mouse foi eliminado de todas as análises. Geral ICH succetaxas ss foram 75-85%, em 50 ratos com mortalidade de 0%.
Figura 2. Testar Cilindro demonstra hemiparesia esquerda após ICH gânglios basais direito. (A) traseira do mouse Amostra após a cirurgia ICH. Observe a colocação de apenas forelimb o direito sobre a parede do cilindro após ICH gânglios basais esquerdo. (B) Gráfico de testes cilindro 1 resultados da coorte de camundongos após ICH cirurgia (n = 5) em comparação com placebo (n = 4). Ratos Sham tiveram todos os procedimentos, exceto a injeção de sangue (agulha foi inserida no cérebro). Cada rato foi colocado em uma de 12 cm de diâmetro do cilindro de vidro claro e observado por 20 partes traseiras. A colocação inicial dos membros anteriores na parede do cilindro foi marcado por de trás. Movimentos posteriores (como a exploração lateral) não foram marcados até o rato voltou para o solo ea parte traseira próxima marcado. O índice foi calculado como a lateralidade (direita # colocações forelimb no lado do cilindro - # deixou colocações forelimb) / (# # direito + esquerdo + # ambos), onde 0 indica nenhuma preferência forelimb e 1 indicado apenas forelimb o direito foi usado .
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Discussion
Este modelo cirúrgico da hemorragia intracerebral em camundongos, utilizando a cauda resultados autólogo de sangue arterial em um modelo reprodutível de hemorragia espontânea gânglios basais. Um modelo em camundongos ICH oferece a vantagem da disponibilidade de animais transgênicos para investigar fisiopatologia, no entanto, seu pequeno tamanho faz com que procedimentos neurocirúrgicos mais tecnicamente difícil do que em animais maiores.
O modelo de colagenase e o modelo de injeção de sangue autólogo são dois modelos bem-estabelecidos de ICH experimental. Enquanto o modelo de colagenase oferece um procedimento mais fácil e uma hemorragia altamente reprodutível 2, a proteína da bactéria usada para degradar a membrana basal poderia efetuar qualquer investigação de respostas inflamatórias inatas. Além disso, colagenase-BBB interrompido unnaturally poderia facilitar o acesso de drogas ao cérebro durante farmacológicos (por exemplo, neuroproteção) experimentos. A varfarina associada modelo ICH recentemente também tem sido desenvolvido 3, que permite investigação de hemorragia expansão para este subgrupo de pacientes. Os benefícios do modelo de sangue autólogo injeção incluem presença de danos mecânicos associada com efeito de massa, um sistema estéril sem proteínas exógenas, a capacidade de eliminar a anticoagulação, a fim de investigar a coagulação natural e vias de inflamação após hemorragia espontânea e controle excelente sobre o tamanho da hemorragia. Uma vez que todos os ratos têm o tamanho hemorragia mesmo, os efeitos de intervenções terapêuticas em ambos os tecidos e os resultados funcionais podem ser estudados com precisão com tamanhos de amostra relativamente pequena.
O procedimento cirúrgico descrito aqui é semelhante a outros modelos publicados usando a injeção de sangue autólogo (4-7), e vários passos em nosso protocolo estavam baseados nestes protocolos publicados. Melhorias significativas nesta técnica incluem a eliminação de toda a tubulação expansível e espaço morto no sistema, o que poderia interferir com a medição precisa do volume de injeção de sangue, a eliminação de todos os anticoagulantes, e um volume de hemorragia moderada grande em comparação com outros modelos de não -anticoagulado sangue. A 15 uL ICH em uma média de 450 uL adulto contas do mouse cérebro para 3% do volume do cérebro. Isto é aproximadamente comparável a um ICH 40 mL no homem, assumindo que o volume normal do cérebro adulto médio é de 1400 mL. Este volume ICH resulta em déficits neurológicos mensuráveis que persistem mais de duas semanas para o estudo de recuperação, mantendo a taxa zero de mortalidade, que é de importância prática quando se utiliza caro animais transgênicos.
Visualização direta desta cirurgia deve eliminar erros comuns e ajuda na facilidade de replicação. Esperemos que isso se traduzirá em uma investigação mais aprofundada sobre os mecanismos de lesão e acelerar o desenvolvimento de terapias em potencial.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O trabalho foi financiado por uma bolsa do Instituto de Medicina Translacional e Terapêutica, e uma bolsa de formação do Instituto de Medicina e Engenharia (T32HL007954) da Universidade da Pensilvânia e da Marlene L. Cohen e H. Jerome Fleisch Scholar Grant no University of Connecticut Health Center (LHS) e NIH NS-029331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
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