Summary
自体血注射在本议定书中所描述的小鼠脑出血模型，采用双色注塑技术，以最大限度地减少了针轨道，在泵送系统中没有抗凝血剂的血液回流的风险，并消除了所有死在空间和系统扩展的油管。
Protocol
1。制备设备
- 擦拭的立体框架，用75％乙醇和泵，以尽量减少细菌污染。
- 消毒汉密尔顿注射器和熔融石英针。
注意：如果使用化学灭菌，使用前一定要在无菌水冲洗数次。 - 石蜡纸的表面，并用75％乙醇擦拭，晾干。
2。制备注射鼠标
注意：有交付给你的动物设施在手术前至少7天，让他们适应环境，以新的环境和减轻压力的小鼠。
- 权衡手术前的基线象征。
- 与氧气30％，70％的一氧化二氮和4％，直到响应尾巴捏异氟醚诱导麻醉
- 注射丁丙诺啡为0.1mg/kg腹腔手术后镇痛的鼠标
- 剃的头皮
- 用无菌凡士林大衣的眼睛
- 准备与x 3优碘擦拭头皮，然后让头皮干燥
- 设为1厘米中线矢状切开头皮，使用无菌手术手术刀
注：一位慷慨的切口，将允许头骨的标志性建筑的完整曝光。 - 剃须开始从底部1厘米的尾巴腹面1厘米，并准备与优碘× 3湿巾
- 将鼠标放置在立体框架
注：重要的是要确保鼠标的安全与颅骨表面平行框架的基础框架与优秀暴露前囟和至少3毫米的前囟权。
3。脑出血手术
注：鼠标在整个手术麻醉，30％的氧气，70％的一氧化二氮，和1-3％异氟醚，连续保持在37 ± 0.5 ° C程序中使用的热敏电阻控制的电热垫和直肠体温计的监测。
- 装上1帧40cc的注射器无菌27克针。
- 调整立体的手臂，直到针，完全超过前囟。
- 调整臂，使针头在2.5毫米，外侧，前囟门和颅骨表面是。
- 手动旋转注射器同时应用帧照顾温柔向下运动并不能完全穿孔头骨，颅骨表面的毛刺孔。
- 手动删除针和完整的毛刺孔用注射器/针
注：通过手工完成的毛刺孔立即承认允许当你有穿孔的头骨和风险降至最低无意中推入脑实质针内表。 - 腹尾部使用无菌手术刀片表面上横切口，并允许动脉血2-3大滴掉落到石蜡纸。然后迅速停止出血，用无菌纱布压力。
- 撤柜17μL到汉密尔顿在泵的注射器和注射器的地方血液。
- 调整立体ARM点5 °，内侧相对垂直轴。
- 仔细调整立体臂，使针尖在毛刺孔头骨，然后低针3.5毫米。
- 等待2分钟，然后退出针0.5毫米（这样的提示是3毫米深）
- 等待5分钟，让大脑重新展开周围的针和减少血液回流在注射针插入轨道的风险。
- 注入7.5μL的血1微升/分钟。
- 等待5分钟，让最初的血液凝固和组织的变化发生，以减低颅内压力升高。
- 余下的7.5μL注入1μL/分钟
- 允许针保持25分钟到位，让血液凝固
注：不退出针时，等待会导致血液凝固的血液回流针插入部位 - 慢慢地退出针，并立即用热水冲洗，以防止凝血任何残血针，确保针重用。
- 从框架中取出鼠标和密切与兽医外科胶尾巴和头皮切口。
- 关闭麻醉。
- 允许鼠标唤醒免费访问蘸食品不断升温而。
- 返回鼠标笼窝时完全清醒。放在笼底湿的食物颗粒，以帮助动物获取食物。
4。代表性的成果：
图1脑出血手术15分钟后鼠脑冠状切面。大脑的非物质文化遗产成功的基础上针插入部位在冠状断面总检查检查后立即牺牲。出血，追查了过去的胼胝体，或入脑室针跟踪大脑底部，被视为不成功，老鼠是从消除所有分析。总体ICH的帅客SS率分别为75％-85％0％的死亡率在50只。
图2。缸测试演示后，右侧基底节脑出血左侧偏瘫。 （一）样本脑出血手术后的鼠标后部。注意筒壁只有右前肢的位置后，左基底节脑出血。 （二）缸测试图1结果从队列后的小鼠脑出血手术治疗（N = 5）相比，假手术组（n = 4）。深水小鼠血液的注入（针插入到大脑）之外的所有程序。每个鼠标被放置在一个直径12厘米的透明玻璃圆筒，并观察20后轮。每后方取得筒壁的前肢的初始位置。随后的动作（如横向探索）没有进球，直到鼠标返回到地面和未来后方得分。偏侧指数计算公式为（＃右前肢拆放圆柱体的侧面 - ＃左前肢配售）/（＃右+左+＃两者），其中0表示没有前肢的偏好和1表示只有右前肢。
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Discussion
这在小鼠的自发性基底节出血重现模型中使用自体尾动脉的血液结果脑出血的手术模型。在小鼠的脑出血模型提供的转基因动物研究病理生理学的可用性的优势，但其体积小，使神经外科手术技术上更比在较大的动物困难。
胶原酶模型和自体血液的注入模型实验性脑出血的两个行之有效的模型。虽然胶原酶模型提供了一个简单的过程和高度重现性出血 2，使用细菌蛋白质的降解基底膜，可能影响任何先天的炎症反应的调查。此外，胶原酶扰乱血脑屏障，可以人为地促进在药理实验（如神经保护作用）的药物进入大脑。一个华法林相关的脑出血模型，最近也得到开发，这使得这种患者出血扩张的调查。自体血液的注入模型的好处包括与质量效应相关的机械损伤，无外源蛋白的无菌系统，能够消除抗凝，以便调查后自发性出血自然凝血和炎症途径，对精美的大小控制的存在出血。由于所有的老鼠有相同的出血大小，可以研究治疗干预的组织和功能结果的影响相对较小的样本大小的精度。
这里所描述的手术过程是类似的其他已发表的模型，采用自体血注射液（4-7），我们的协议中的几个步骤，对这些公布的协议为基础。在这种技术的重大改进，包括消除系统中的所有扩展油管和死亡空间，这有可能干涉的血液的注入，消除所有的抗凝血剂，和一个中等大小的出血量量的准确测量相比其他型号的非抗凝血液。 15 UL非物质文化遗产在平均450 UL成年鼠大脑对大脑体积的3％帐户。这是大致相当于一个人的脑出血40毫升，假设正常成人平均脑容量为1400毫升。在衡量的，持续了两个多星期的恢复研究，同时保持零死亡率，是使用昂贵的转基因动物时的实际重要性的神经功能缺损，脑出血量的结果。
这种手术的直接可视化，应消除常见的错误和便于复制的援助。希望这将转化成损伤机制的进一步调查和加快发展的潜在疗法。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由一个转化医学和治疗学研究所的奖学金，并从医学和工程（T32HL007954）研究所的培训补助金，在美国宾夕法尼亚大学和马琳L.科恩和Jerome H. Fleisch学者格兰特在康涅狄格大学卫生中心（LHS）和国立卫生研究院NS - 029331（一汽）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
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