Summary
Le modèle d'injection de sang autologue d'hémorragie intracérébrale chez la souris décrites dans ce protocole utilise la technique de double injection pour minimiser le risque de reflux du sang jusqu'à la piste d'aiguille, pas d'anticoagulants dans le système de pompage, et élimine tous les espaces morts et tuyaux extensibles dans le système.
Protocol
1. Préparation du matériel
- Essuyez le cadre stéréotaxique et de la pompe avec de l'éthanol à 75% afin de minimiser la contamination bactérienne.
- Stériliser seringue Hamilton et l'aiguille de silice fondue.
Remarque: Si la stérilisation chimique est utilisé, n'oubliez pas de rincer plusieurs fois dans de l'eau stérile avant utilisation. - Essuyez la surface du papier de paraffine avec de l'éthanol 75% et laisser sécher.
2. Préparation de la souris pour l'injection
Note: Avez-souris livré à votre animalerie au moins 7 jours avant la chirurgie afin de leur permettre de s'acclimater à leur nouvel environnement et à réduire le stress.
- Peser la souris pour le pré-opératoire de base.
- Induire une anesthésie avec 30% d'oxygène, 70% d'oxyde nitreux, et 4% d'isoflurane jusqu'au insensibles à pincement de la queue
- Injecter de la souris avec la buprénorphine par voie intrapéritonéale pendant 0.1mg/kg analgésie postopératoire
- Rasage du cuir chevelu
- Manteau avec les yeux de la vaseline stérile
- Préparer le cuir chevelu avec de la Bétadine x 3 lingettes, puis laisser sécher le cuir chevelu
- Faire une incision médiane sagittale cm du cuir chevelu à l'aide stériles scalpel chirurgical
Remarque: Une incision généreuse permettra une exposition complète de repères crâne. - Rasage de 1 cm de la surface ventrale de la queue commence à 1 cm de base et préparer avec la bétadine x 3 lingettes
- Placez la souris sur le cadre de stéréotaxie
Note: Il est important de s'assurer de la souris est en sécurité dans le cadre avec la surface du crâne parallèles avec la base du châssis, avec une excellente visibilité du bregma et au moins 3 mm à la droite du bregma.
3. Chirurgie de l'hémorragie intracérébrale
Notes: Durant toute la chirurgie de la souris est anesthésié avec 30% d'oxygène, 70% d'oxyde nitreux, et 1-3% isoflurane, constamment maintenue à 37 ± 0,5 ° C à l'aide d'une thermistance contrôlée coussin chauffant et surveillé par un thermomètre rectal.
- Fixez stériles aiguille 27 G sur une seringue de cc sur le châssis.
- Ajustez le bras stéréotaxique jusqu'au aiguille est exactement sur bregma.
- Ajustez le bras de telle sorte que l'aiguille est à 2,5 mm latéralement à bregma et inférieure à la surface du crâne.
- Faites tourner manuellement seringue pour faire trou de trépan sur la surface du crâne tout en appliquant douce mouvement de baisse de frame-en prenant soin de ne pas complètement perforer le crâne.
- Retirer l'aiguille et remplir trou de trépan manuellement avec une seringue / aiguille
Remarque: Remplir le trou de trépan à la main permet la reconnaissance immédiate lorsque vous avez perforé la table interne du crâne et minimise les risques d'inadvertance pousser l'aiguille dans le parenchyme cérébral. - Faire une incision transversale sur la surface ventrale de la queue à l'aide stériles lame chirurgicale et permettre 2-3 gouttes de sang artériel grandes pour tomber sur du papier de paraffine. Puis rapidement arrêter le saignement avec la pression à l'aide de gaze stérile.
- Retirer 17 uL de sang dans la seringue et la seringue Hamilton place sur la pompe.
- Ajustez le bras stéréotaxique au point 5 ° médial par rapport à l'axe vertical.
- Ajustez soigneusement le bras stéréotaxique de telle sorte que la pointe de l'aiguille est sur le trou de trépan dans le crâne, puis abaissez l'aiguille de 3,5 mm.
- Attendre 2 minutes puis retirer l'aiguille de 0,5 mm (de sorte que la pointe est de 3 mm de profondeur)
- Attendre 5 minutes pour permettre au cerveau de re-développer autour de l'aiguille et de minimiser les risques de reflux de sang jusqu'à la piste insertion de l'aiguille lors de l'injection.
- Injecter du sang 1 ul / minute pour 7,5 uL.
- Attendez 5 minutes pour permettre au sang de la coagulation et initiales pour les quarts de tissus de se produire pour minimiser les élévations de la pression intracrânienne.
- Injecter le reste 7,5 pi à 1 ul / minute
- Laisser l'aiguille de rester en place pendant 25 minutes pour permettre la coagulation du sang
Remarque: Si vous n'attendez pas la coagulation du sang se traduira dans le sang reflux jusqu'à l'emplacement insertion de l'aiguille lors du retrait de l'aiguille - Lentement retirer l'aiguille et rincer immédiatement avec de l'eau chaude, pour éviter toute trace de sang résiduel dans l'aiguille de la coagulation et d'assurer la réutilisabilité de l'aiguille.
- Retirez la souris du cadre et à proximité de la queue et les incisions du cuir chevelu avec de la colle chirurgicale vétérinaire.
- Éteignez l'anesthésie.
- Laisser la souris pour réveiller tout en étant constamment réchauffé avec libre accès à la nourriture humide.
- Retour à la souris en cage avec la même portée une fois pleinement éveillé. Placer la nourriture humide granulés sur le fond de la cage pour aider les animaux dans l'accès à la nourriture.
4. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Coupe coronale de cerveau de souris 15 minutes après la chirurgie ICH. Immédiatement après le sacrifice du cerveau a été inspecté pour la réussite CIH basée sur l'inspection brute d'une coupe coronale au site d'insertion de l'aiguille. Les hémorragies qui a suivi jusqu'à la base du cerveau, le trajet de l'aiguille passé le corps calleux, ou dans les ventricules ont été jugées infructueuses et que la souris a été éliminée de toutes les analyses. Globalement ICH succetaux de SS étaient à 75-85% dans les 50 souris avec une mortalité de 0%.
Test Figure 2. Cylindre démontre une hémiparésie gauche après l'ICH ganglions droit basale. (A) à l'arrière de la souris échantillon après la chirurgie ICH. Notez que le placement de la patte avant droite sur la paroi du cylindre, après l'ICH ganglions laissé basale. (B) Graphique des tests de cylindre 1 des résultats de la cohorte de souris après l'ICH chirurgie (n = 5) par rapport à fictive (n = 4). Souris Sham avait toutes les procédures d'injection, sauf le sang (aiguille a été insérée dans le cerveau). Chaque souris a été placée dans un cylindre de 12 cm de diamètre en verre clair et observés pendant 20 arrières. Le placement initial des membres antérieurs sur la paroi du cylindre a été marqué par l'arrière. Mouvements ultérieurs (tels que l'exploration latérale) ne sont pas marqué tant que la souris retournée dans le sol et l'arrière à côté marqué. L'indice a été calculé comme la latéralité (# droite stages forelimb sur le côté du cylindre - # laissé stages forelimb) / (# # droite + gauche + # fois), où 0 indique pas de préférence des membres antérieurs et une indication que la patte avant droite a été utilisé .
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Discussion
Ce modèle chirurgical de l'hémorragie intracérébrale chez des souris en utilisant les résultats autologues de sang dans l'artère la queue un modèle reproductible d'hémorragie spontanée ganglions basaux. Un modèle chez la souris CIH offre l'avantage de la disponibilité des animaux transgéniques pour étudier la physiopathologie, mais leur petite taille les rend interventions neurochirurgicales techniquement plus difficile que dans les grands animaux.
Le modèle de la collagénase et le modèle d'injection de sang autologue sont deux modèles bien établis de l'ICH expérimental. Alors que le modèle de la collagénase propose une procédure plus simple et une hémorragie hautement reproductible 2, la protéine bactérienne utilisée pour dégrader la membrane basale pourrait effectuer toute enquête sur innée des réponses inflammatoires. En outre, la collagénase-perturbé BBB pourrait anormalement faciliter l'accès des médicaments vers le cerveau pendant pharmacologiques (par exemple, la neuroprotection) expériences. Un modèle de la warfarine associée à l'ICH a également été récemment mis au point 3, qui permet l'étude de l'expansion de cette hémorragie sous-ensemble de patients. Les avantages du modèle de l'injection de sang autologue incluent la présence de dommages mécaniques associées à un effet de masse, un système stérile sans protéines exogènes, la capacité d'éliminer l'anticoagulation afin d'enquêter sur la coagulation naturelles et les voies inflammation après une hémorragie spontanée, et un contrôle exquis sur la taille de l'hémorragie. Comme toutes les souris ont la taille hémorragie même, les effets des interventions thérapeutiques sur les deux tissus et les résultats fonctionnels peuvent être étudiés avec précision avec un échantillon relativement petit.
La procédure chirurgicale décrite ici est similaire à d'autres modèles édités en utilisant l'injection de sang autologue (4-7), et plusieurs étapes dans notre protocole sont basées sur ces protocoles publiés. Des améliorations significatives de cette technique comprennent l'élimination de tous les tubes extensibles et espace mort dans le système, ce qui pourrait interférer avec la mesure précise du volume d'injection de sang, l'élimination de tous les anticoagulants, et un volume de l'hémorragie modérément grande par rapport à d'autres modèles de la non anticoagulé sang. A l'ICH 15 uL dans une moyenne de 450 comptes pour adultes uL cerveau de souris de 3% du volume du cerveau. C'est à peu près comparable à un ICH 40 ml chez l'homme, en supposant que la normale volume moyen du cerveau adulte est 1400 ml. Ce volume se traduit par l'ICH mesurables déficits neurologiques qui persistent plus de deux semaines pour l'étude de la récupération tout en maintenant à zéro le taux de mortalité, qui est d'une importance pratique lorsque vous utilisez onéreux des animaux transgéniques.
La visualisation directe de cette chirurgie doit éliminer les erreurs communes et l'aide en termes de facilité de réplication. J'espère que cela va se traduire par une enquête plus approfondie sur les mécanismes de blessures et d'accélérer le développement de thérapies potentielles.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le travail a été financé par une bourse de l'Institut pour la médecine translationnelle et de thérapeutique, et une bourse de formation de l'Institut de médecine et d'ingénierie (T32HL007954) à l'Université de Pennsylvanie et de l'Marlene L. Cohen et Jérôme H. Fleisch Scholar Subvention à la University of Connecticut Health Center (LHS) et NIH NS-029331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
- Foerch, C., Arai, K., Jin, G., Park, K. -P., Pallast, S., van Leyen, K., Lo, E. H. Experimental Model of Warfarin-Associated Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 39, 3397-3404 (2008).
- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
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