Summary
El modelo de inyección de sangre autóloga de la hemorragia intracerebral en ratones descritos en este protocolo se utiliza la técnica de doble inyección para minimizar el riesgo de reflujo de sangre hasta el trayecto de la aguja, no los anticoagulantes en el sistema de bombeo, y elimina todo el espacio muerto y el tubo extensible en el sistema.
Protocol
1. Preparación del equipo
- Limpie el marco estereotáxico y la bomba con el 75% de etanol para minimizar la contaminación bacteriana.
- Esterilizar la jeringa y la aguja Hamilton silicio fundido.
Nota: Si la esterilización química se utiliza, asegúrese de enjuagarse varias veces con agua estéril antes del uso. - Limpie la superficie de papel de cera de parafina con un 75% de etanol y dejar secar.
2. Preparación de ratón para la inyección
Nota: Tenga ratones entregado a su instalación de animales al menos 7 días antes de la cirugía para permitir que se aclimate al nuevo ambiente y reducir el estrés.
- Pesar del ratón para la pre-operatoria de referencia.
- Inducir la anestesia con un 30% de oxígeno, 70% de óxido nitroso, y el 4% isoflurano hasta que no responden a pellizcar la cola
- Inyectar al ratón con buprenorfina 0.1mg/kg por vía intraperitoneal para la analgesia postoperatoria
- Afeitarse el cuero cabelludo
- Los ojos con agua estéril capa de vaselina
- Preparar el cuero cabelludo con betadine x 3 paños, y luego permitir que se seque el cuero cabelludo
- Haga una incisión sagital cm la línea media del cuero cabelludo con bisturí quirúrgico estéril
Nota: Se hace una incisión generosa permitirá la exposición completa de los hitos del cráneo. - Afeitado 1 cm de la superficie ventral de la cola a partir del 1 cm de base y preparar con betadine x 3 toallitas
- Coloque el ratón sobre el marco estereotáxico
Nota: Es importante asegurarse de ratón está seguro en el marco de la superficie del cráneo es paralela a la base de la estructura, con una excelente exposición de bregma y por lo menos 3 mm a la derecha del bregma.
3. Cirugía de la hemorragia intracerebral
Notas: Durante toda la cirugía del ratón se anestesia con un 30% de oxígeno, 70% de óxido nitroso, y el 1-3% de isoflurano, continuamente mantiene a 37 ± 0,5 ° C con una resistencia térmica controlada almohadilla térmica y control de un termómetro rectal.
- Coloque la aguja estéril 27 g en una jeringa de 1 cc en el marco.
- Ajuste el brazo hasta que la aguja estereotáxica es exactamente más de bregma.
- Ajuste el brazo para que la aguja está en 2,5 mm lateral a bregma e inferior a la superficie del cráneo.
- Gire manualmente la jeringa para trepanación del cráneo en la superficie mientras se aplica el movimiento suave hacia abajo de la atención marco de la toma de no perforar el cráneo por completo.
- Se retira la aguja y el agujero de trépano completo manual con jeringa / aguja
Nota: Completar el agujero de trépano a mano permite el reconocimiento inmediato cuando haya perforado la tabla interna del cráneo y minimiza el riesgo de empujar inadvertidamente la aguja en el parénquima cerebral. - Realice una incisión transversal en la superficie ventral de la cola con hoja de bisturí estéril y dejar 2-3 gotas grandes de sangre arterial a caer en el papel de cera de parafina. Entonces, rápidamente, detener el sangrado con presión con una gasa estéril.
- Retirar 17 l de sangre en la jeringa y una jeringa Hamilton lugar en la bomba.
- Ajuste el brazo estereotáxica a punto 5 ° medialmente con relación al eje vertical.
- Ajuste cuidadosamente el brazo estereotáxica manera que la punta de la aguja sobre el agujero de trépano en el cráneo y luego baje la aguja 3,5 mm.
- Espere 2 minutos y luego retirar la aguja de 0,5 mm (de modo que la punta es de 3 mm de profundidad)
- Espere 5 minutos para permitir que el cerebro se expanda de nuevo alrededor de la aguja y minimizar el riesgo de reflujo de sangre por el camino de inserción de la aguja durante la inyección.
- Inyectar sangre 1 l / min para 7,5 mL.
- Esperar 5 minutos para permitir que la sangre inicial de coagulación y para los turnos de los tejidos que se produzcan para minimizar las elevaciones de la presión intracraneal.
- Inyectar el restante 7,5 l de 1 l / minuto
- Permita que la aguja permanezca en su lugar durante 25 minutos para permitir la coagulación de la sangre
Nota: Si no espera por coagulación de la sangre se traducirá en la sangre de reflujo hasta el sitio de inserción de la aguja al retirar la aguja - Lentamente retire la aguja e inmediatamente enjuague con agua caliente para evitar que restos de sangre en la aguja de la coagulación y de garantizar la reutilización de agujas.
- Quitar el ratón de la estructura y cerca de la cola y las incisiones del cuero cabelludo con pegamento quirúrgico veterinario.
- Apague la anestesia.
- Dejar el ratón para despertar mientras se calienta continuamente con libre acceso al alimento humedecido.
- Volver a la jaula del ratón con la camada cuando esté completamente despierto. Lugar húmedo comida de pellets en la parte inferior de la jaula para ayudar a los animales en el acceso a los alimentos.
4. Los resultados representativos:
Figura 1. Sección coronal de cerebro de ratón 15 minutos después de la cirugía de la ICH. Inmediatamente después del sacrificio del cerebro fue examinado por el éxito ICH basado en la inspección macroscópica de un corte coronal en el sitio de inserción de la aguja. Hemorragias que dio seguimiento a la base del cerebro, el trayecto de la aguja más allá del cuerpo calloso, o en los ventrículos se considerará fracasada y que el ratón fue eliminado de todos los análisis. En general succe ICHlas tasas de las SS fueron 75-85% en 50 ratones con 0% de mortalidad.
Prueba de la Figura 2. Cilindro demuestra hemiparesia izquierda después de ICH derecho de los ganglios basales. (A) muestra parte trasera del ratón después de la cirugía ICH. Tenga en cuenta la colocación de la extremidad anterior derecha sólo en la pared del cilindro después de ICH izquierda los ganglios basales. (B) Gráfico de las pruebas de un cilindro de resultados de la cohorte de ratones después de la cirugía de la ICH (n = 5) en comparación con el tratamiento simulado (n = 4). Ratones Sham había todos los procedimientos, excepto la inyección de sangre (aguja se inserta en el cerebro). Cada ratón fue colocado en un cilindro de vidrio de 12 cm de diámetro interior y observaron durante 20 traseros. La colocación inicial de los miembros anteriores de la pared del cilindro fue anotado por detrás. Los movimientos posteriores (como la exploración lateral) no se obtuvo hasta que el ratón volvió a la tierra y anotó la parte trasera que viene. El índice se calcula como la lateralidad (# ubicaciones adecuadas extremidad anterior en el lado del cilindro - # izquierda colocaciones extremidad anterior) / (# + # derecha izquierda + # ambos), donde 0 indica ninguna preferencia patas delanteras y 1 indica que sólo la extremidad anterior derecha se utilizó .
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Discussion
Este modelo quirúrgico de la hemorragia intracerebral en ratones utilizando autólogo cola resultados sanguíneo de la arteria en un modelo reproducible de la hemorragia espontánea ganglios basales. Un modelo en ratones ICH ofrece la ventaja de la disponibilidad de animales transgénicos para investigar la fisiopatología, sin embargo, su pequeño tamaño hace que los procedimientos neuroquirúrgicos técnicamente más difícil que en los animales más grandes.
El modelo de la colagenasa y el modelo de inyección de sangre autóloga son dos modelos bien establecidos de ICH experimental. Mientras que el modelo de la colagenasa ofrece un procedimiento más sencillo y una hemorragia muy reproducibles 2, la proteína bacteriana utilizada para degradar la membrana basal potencialmente podría afectar a cualquier investigación de la respuesta inflamatoria innata. Además, la colagenasa-interrumpió BBB antinatural podría facilitar el acceso de drogas al cerebro durante el farmacológico (por ejemplo, la neuroprotección) experimentos. Un modelo de warfarina asociada ICH ha sido desarrollada recientemente 3, que permite la investigación de la expansión de la hemorragia para este subgrupo de pacientes. Los beneficios del modelo de inyección de sangre autóloga incluyen la presencia de daños mecánicos asociados con efecto de masa, un sistema estéril sin proteínas exógenas, la capacidad de eliminar la anticoagulación con el fin de investigar la coagulación natural y las vías de la inflamación después de la hemorragia espontánea, y un exquisito control sobre el tamaño de la hemorragia. Dado que todos los ratones tienen el tamaño de la hemorragia misma, los efectos de las intervenciones terapéuticas en los tejidos y los resultados funcionales pueden ser estudiados con precisión con muestras relativamente pequeñas.
El procedimiento quirúrgico se describe aquí es similar a otros modelos publicados con inyección de sangre autóloga (4-7), y varios pasos en el protocolo se basa en los protocolos publicados. Mejoras significativas en esta técnica incluyen la eliminación de todos los tubos extensibles y el espacio muerto en el sistema, lo que podría interferir con la medición exacta del volumen de los inyectados de sangre, la eliminación de todos los anticoagulantes, la hemorragia y un volumen relativamente grande en comparación con otros modelos de la no anticoagulado sangre. A 15 uL ICH en un promedio de 450 cuentas de cerebro de ratón adulto uL el 3% del volumen del cerebro. Esto es comparable a un ICH 40 ml en el hombre, en el supuesto normal de volumen medio cerebro adulto es de 1400 ml. Este volumen ICH resultados medibles en los déficit neurológicos que persisten más de dos semanas para el estudio de la recuperación, manteniendo a cero la tasa de mortalidad, que es de importancia práctica cuando se utilizan costosos animales transgénicos.
Visualización directa de esta cirugía debe eliminar los errores más comunes y ayudan a la facilidad de replicación. Esperemos que esto se traducirá en una mayor investigación sobre los mecanismos de lesión y acelerar el desarrollo de terapias potenciales.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo fue financiado por una beca del Instituto de Medicina Traslacional y Terapéutica, y una beca de formación del Instituto de Medicina e Ingeniería (T32HL007954) de la Universidad de Pennsylvania y la Marlene L. Cohen y Jerome H. Fleisch Académico Grant en la Universidad de Connecticut Health Center (LHS) y NIH NS-029331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
- Hua, Y., Schallert, T., Keep, R. F., Wu, J., Hoff, J. T., Xi, G. Behavioral Tests After Intracerebral Hemorrhage in the Rat. Stroke. 33, 2478-2484 (2002).
- James, M., Warner, D., Laskowitz, D. Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage: A Translational Perspective. Neurocritical Care. 9, 139-152 (2008).
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- Nakamura, T., Xi, G., Hua, Y., Schallert, T., Hoff, J. T., Keep, R. F. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 24, 487-494 (2004).
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