Summary
这个视频协议演示了如何真正的神经干细胞在一个混合使用的神经细胞集落形成细胞分析的神经前体细胞人口歧视和枚举。
Abstract
神经球吸附试验（NSA）是最常用的方法，隔离开来，扩大，并计算出神经干细胞（NSCs）的频率之一。此外，本无血清培养系统也被扩大干细胞，并确定它们的频率从各种肿瘤和正常组织。最近，它已被证明，神经球的形成和神经干细胞之间不存在一个以一对一的关系。这表明，目前适用的国家安全局，高估了一个混合的人口从胚胎和成年哺乳动物大脑的神经前体细胞神经干细胞的频率。实际上该视频演示了一种新的胶原蛋白为基础的半固体含量，神经细胞集落形成细胞分析（N CFCA），它具有歧视基于其长期的增殖潜能的祖细胞的干的能力，从而提供了一种方法枚举国科会的频率。在N - CFCA殖民地≥2毫米，直径是来自细胞，满足了NSC的所有功能标准，而殖民地<2毫米祖细胞衍生。可用于从不同的来源，包括小学和培养成人或胚胎小鼠中枢神经系统的细胞准备细胞的N - CFCA程序。在这里，我们使用准备通过从胚胎14天小鼠大脑产生执行N - CFCA一个神经球的细胞。培养增殖培养基补充了三个星期，每7天允许镀细胞表现出充分的增殖潜能，然后神经祖和真正的神经干细胞的频率计数的菌落<2毫米数分别计算和那些在最初镀细胞数量≥2毫米。
Protocol
1。需要细胞电镀之前准备的项目：
- 完成国科会培养基的准备适当的音量NeuroCult NSC基础培养基和NeuroCult NSC增殖辅料，分别在9:1的比例混合。
- NeuroCult NCFC无血清培养基的无细胞因子等分解冻。
- 在37℃水浴介质预热。
- 表皮生长因子（EGF），碱性成纤维细胞生长因子（b - FGF的）在浓度为10微克/毫升和0.2％肝素联合解决方案，提前准备。
- 根据实验的大小，需要几个35mm组织培养的菜肴板的细胞和一个150至200cm的塑料培养皿中，还需要举行重复的35mm菜和第三水35毫米菜。
2。细胞制备：
根据你的实验，细胞可从成人或胚胎的来源（主要分离组织或游离神经球）的准备。剖析从成人/胚胎小鼠中枢神经系统（CNS）组织或游离于前1,2，然后描述成人/胚胎源性神经球：
- 的是通过一个40微米大小的网状过滤器通过的单细胞悬液，以消除非游离团块。
- 台盼蓝90μl，进行细胞计数细胞悬液10μL 混合注 ：也可用于其他合适的细胞稀释。
- 如果使用的是初级胚胎或成人的神经细胞，稀释的细胞悬液浓度6.5 × 10 5细胞/毫升在完成国科会培养基。如果使用的是从成人或胚胎神经细胞产生的游离神经球细胞，稀释细胞悬液浓度2.2 × 10 5细胞/毫升在完成国科会培养基。
3。半固态的N - CFCA中等电镀细胞：
- 混合，以适当的音量以下几部分组成，上复制的数量而定。在这里，我们混合了两所需要的金额复制或重复的菜肴。复制其他号码，请参阅表1。
- 1.7毫升NeuroCult NCFC无血清培养基，无细胞因子
- 330μLNeuroCult NSC增殖辅料
- 6.6μL表皮生长因子（10μg/mL）
- 32μL青霉素/链霉素。
- 3.3μLB - FGF（10μg/mL）时才需要培养成人神经细胞产生的细胞。
- 3.3μL肝素（0.2％）时才需要培养成人神经细胞产生的细胞 。
- 25μL细胞悬液（2.2 × 10 5细胞/ ml的分离神经球或6.5 × 10 5细胞/毫升原代细胞从组织分离的中枢神经系统细胞）注：镀金的最后一个单元格的数字应约2500每35毫米培养皿中的细胞衍生的神经干细胞和7500细胞的原代细胞每35 mm培养皿。在某些情况下，最终细胞电镀密度要通过执行一个单元滴定实验调整。对于统计分析，经过21天的文化检测菌落总数应在范围内至少有50 - 150菌落。
- 轻轻地，然后是混合细胞的培养基中含有1.3毫升冷胶原溶液转移到细胞悬液，轻轻吹打混合，以避免任何气泡。
- 的混合溶液配发到每个35mm的培养皿（〜1.5毫升/皿）的中心和菜都轻轻放倒，使用打圈，让分布在菜的表面均匀的混合物。 。
- 重复35毫米培养皿中放入一个100毫米的Petri板。新的35毫米培养皿的盖子被删除，开放的菜也是相同的100毫米的培养皿中。无菌水添加到这个开放的35毫米盘保持在孵化期间的最佳湿度。广场生物测定板（245毫米），使用时复制35毫米的菜已经建立起来。同样，包括2个或3开放35 mm培养皿无菌水。
- 板块转移一个孵化器设定在37℃，5％CO2和95％的湿度。通过增加温度和凝胶形成的胶原蛋白凝结会发生在大约一个小时。的文化不应该在此期间受到干扰。
- 培养的细胞培养21天（群体规模的差异，在21天以后可以清楚地分辨）。
4。准备增资的中型和喂养文化：
孵育时间（21天）的延长期的N - CFCA文化，文化应投喂与适当的完整NeuroCult 增资中期准备新鲜如下：
- NeuroCult NSC基础培养基的4.5毫升混合0.5米NeuroCult NSC增殖辅料，然后生长因子的L是：
- 250μL10μg/mL表皮生长因子（给予终浓度为0.5μg/ mL的EGF）
- 125μLB - FGF10μg/mL（给予终浓度为0.25μg/mLB - FGF） 时才需要培养成人神经细胞产生的细胞。
- 125μL0.2％肝素， 只有培养成人神经细胞产生的细胞。
- 60μL适当完成NeuroCult补货中（胚胎或成年细胞）添加到每个NCFC含量菜每7天一次，在整个NCFC含量文化潜伏期（21天）的中心。
5。得分的N - CFC含量派生殖民地和真正的神经干细胞和神经祖细胞的频率计算：
- 每个35 mm培养皿放置在一个2.0毫米× 2.0毫米的网格大小的网格得分菜，两个菜，然后放在显微镜舞台上。
- 使用低功率（2.5倍 - 5倍）物镜，每道菜扫描，并根据它们的大小的殖民地都取得了。
- 殖民地分为两大类：
- 直径小于2毫米
- 直径≥2毫米
6。代表性的成果：
由于在检测神经球，在镀上的N - CFC检测的细胞开始增殖，使细胞内的小菌落电镀后3 - 7天（图1）。在两个星期的时间，可以区分不同大小的菌落。虽然大多数的殖民地往往在14天后停止增长，一些殖民地继续扩大规模。第21天，菌落可分为四类：1）直径小于0.5毫米，2）0.5 - 1毫米直径，3）1 - 2毫米直径4）直径≥2毫米。实际上，小于2毫米直径的殖民地被称为祖派生（图2）和殖民地≥直径2mm被称为国科会派生（图3）。殖民地≥2毫米每镀细胞总数的直径，代表长期的自我更新和多潜能的能力，实际真正的神经干细胞的频率。据估计总的神经球，在一个特定的细胞群形成后7-8天在一个平行的国家安全局实验的频率类似的总菌落形成后21天在一个N - CFCA实验相同的细胞群的频率。的N - CFCA然而，提供了一个更宽松的条件，使每个单元可以充分显示其增殖潜力。
| 组件 | 2复制 | 重复3次 | 4个重复 |
| NeuroCult NCFC无细胞因子的无血清培养基 | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult国科会扩散辅料 | 330 | 495 | 660 |
| EGF（10微克/毫升） | 6.6 | 9.9 | 13.2 |
| 碱性成纤维细胞生长因子（10微克/毫升）， 仅适用于成年细胞 | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| 肝素溶液（0.2％）， 仅适用于成年细胞 | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| 青霉素/链霉素（1:100） | 32 | 48 | 64 |
| 细胞在： 2.2 × 10 5培养细胞/ mL或 6.5 × 10 5的主要细胞/ ml | 25 | 37.5 | 50 |
| 胶原溶液 | 1300 | 1950年 | 2600 |
表1。完整的N - CFC检测文化的组成部分。
图1 CFCA的N -通道之一，E14小鼠的NSCs文化的代表殖民地后7天电镀。殖民地可能会显示不同的形态和大小。原始的放大倍率; 4X
图2不同大小的N - CFCA通过文化之一，E14电镀后21天的小鼠的NSCs的代表祖派生殖民地。如图所示，殖民地有不同的形态，但都少2毫米大小。原始的放大倍率; 4X
图3。代表真正的干细胞衍生的N - CFCA通过电镀后21天之一，E14小鼠的NSCs的文化殖民地。干细胞衍生的殖民地，可能会显示不同的形态（见视频），但所有≥2毫米直径。原始的放大倍率; 4X
Discussion
虽然神经干检测3,1,2是最常用的方法，隔离和扩大像成人和胚胎的中枢神经系统组织的各种来源的神经干细胞，它不能准确地测量在混居的神经前体细胞的NSC频率（茎祖细胞），因为没有神经球的数量和真正的干细胞 4之间的一对一关系。为了解决这个限制，原国家安全局已被改编，让神经干细胞和祖细胞成长为三个星期5-7充分发挥其扩散能力。与液体NSA的不同的是，在N - CFCA殖民地实际上是克隆而得，半固态的胶原基质防止单细胞镀和菌落聚集的迁移。对于这个实验的结果一致，我们建议：
- 确保一个单细胞悬液，在原来的细胞悬液。穿过40微米大小的网状过滤器，你的单细胞悬液，以消除非游离团块。
- 保持胶原蛋白溶液在4 ° C冰箱冰或。胶原蛋白是最后一个项目被添加到混合细胞悬液，因为它通过增加温度凝结。
- 不要忘了喂文化每周。添加补充培养基中含有生长因子（S）每7天一次，将使细胞继续增殖扩展文化时期。
- 最后的细胞电镀密度进行了优化，从小学或培养的神经细胞衍生的细胞，使经过21天的文化在检测菌落总数的NCFC内的范围内至少有50 - 200菌落。此范围内允许直径样品中罕见的NSC派生殖民地>2毫米检测，同时提供足够数量的统计分析的殖民地。根据起始细胞源，显着减少（<50）和更高的数字（250）菌落有时获得。将导致菌落>2毫米太少菌落直径低于检测水平，而太多的殖民地，会造成人满为患anddepletion生长介质中产生的组件在一个不准确的菌落计数。因此细胞电镀密度将需要作相应的调整（即增加或减少总数的细胞镀）
Disclosures
作者之一，沙龙A.路易斯，是隶属于与干细胞技术公司，在这项研究中所使用的一些试剂生产商。
Acknowledgments
这项工作是从Overstreet基金会的资金支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
