Summary
Questo protocollo video viene illustrato come discriminare ed enumerare in buona fede le cellule staminali neurali in una popolazione mista di cellule precursori neurali utilizzando il neurali che formano colonie test cell.
Abstract
Il test neurosfere (NSA) è uno dei metodi più frequentemente utilizzati per isolare, espandere e anche calcolare la frequenza di cellule staminali neurali (NSC). Inoltre, questo siero privo di sistema di coltura è stato utilizzato per espandere le cellule staminali e determinare la loro frequenza da una varietà di tumori e tessuti normali. E 'stato dimostrato recentemente che uno-a-uno non esiste tra formazione neurosfere e NSC. Questo suggerisce che la NSA come attualmente applicato, sovrastima la frequenza di NSCs in una popolazione mista di cellule precursori neurali isolate dal cervello sia embrionali che adulte dei mammiferi. Questo video dimostra praticamente un romanzo a base di collagene semi-solido saggio, il neuro-formanti colonia test delle cellule (N-ACCP), che ha la capacità di discriminare staminali da cellule progenitrici in base al loro lungo termine potenziale proliferativo e, quindi, fornisce un metodo per enumerare frequenza NSC. Nella N-ACCP, colonie ≥ 2 mm di diametro sono derivati da celle che soddisfano tutti i criteri funzionali di NSC, mentre le colonie <2mm sono derivati da progenitori. L'N-ACCP procedura può essere utilizzata per le cellule preparate da fonti diverse tra cui adulti primarie e colta o embrionali sistema nervoso centrale del mouse cellule. Qui usiamo le cellule preparate dal passaggio uno neurosfere generato dal primo giorno 14 embrionale del cervello nei topi per eseguire N-ACCP. Le culture sono rifornito con la proliferazione di media ogni sette giorni per tre settimane per consentire alle cellule placcato ad esporre il loro pieno potenziale proliferativo e quindi la frequenza delle progenitrici neurali e in buona fede le cellule staminali neurali è calcolato rispettivamente contando il numero di colonie che sono <2mm e quelli che sono ≥ 2 millimetri in riferimento al numero di cellule che sono stati inizialmente placcato.
Protocol
1. Elementi che devono essere preparate prima di procedere alla placcatura Cell:
- Volume appropriato di completo media NSC è preparata mescolando NeuroCult medio basale NSC e NeuroCult NSC Supplementi proliferazione con un rapporto 9:1, rispettivamente.
- Un'aliquota di NeuroCult NCFC mezzo privo di siero senza citochine è scongelato.
- Il mezzo è riscaldato in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Soluzioni stock di fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita fibroblastico base (b-FGF) alla concentrazione di 10 mg / ml ed eparina a 0,2% sono preparati in anticipo.
- A seconda delle dimensioni esperimento, 35 millimetri diversi piatti colture di tessuti sono necessari per la piastra di cellule e un piatto 150-200cm plastica Petri è necessario anche per tenere i piatti duplicare 35mm e un piatto terza 35mm per l'acqua.
2. Preparazione delle cellule:
A seconda del vostro esperimento, le cellule possono essere preparati da una fonte adulte o embrionali (primaria del tessuto dissociati o neurosfere dissociato). Sezionare tessuti di adulti / embrionale del mouse sistema nervoso centrale (SNC) o dissociarsi neurosfere adulto / embrionali derivate, come descritto prima 1,2 e poi:
- La sospensione singola cellula viene fatta passare attraverso un 40-micron di dimensioni filtro a rete in modo da eliminare non dissociati grumi.
- 10μl di sospensione cellulare viene miscelato con 90μl di Blu tripano per eseguire una conta cellulare. Nota: altre diluizioni cella appropriata può anche essere usato.
- Se si utilizza embrionale primario o adulto cellule derivate neurali, diluire la sospensione cellulare ad una concentrazione di 6,5 x 10 5 cellule / ml in totale medio NSC. Se si utilizzano le cellule dissociate da neurosfere derivate da cellule neurali adulte o embrionali, diluire la sospensione cellulare ad una concentrazione di 2,2 x 10 5 cellule / ml in totale medio NSC.
3. Cellule placcatura in semi-solido N-ACCP Media:
- Il volume appropriato di seguenti componenti è mescolato in ordine, a seconda del numero di repliche. Qui mescolare la quantità necessaria per due repliche o duplicare i piatti. Per gli altri numeri delle repliche, si prega di fare riferimento alla tabella 1.
- 1,7 ml di NeuroCult NCFC mezzo privo di siero senza Citochine
- 330 ml di NeuroCult NSC Supplementi proliferazione
- 6,6 ml di EGF (10μg/mL)
- 32 ml di penicillina / streptomicina
- 3,3 ml di b-FGF (10μg/mL) necessaria solo se le cellule derivate da colture di cellule neurali adulte.
- 3,3 ml di eparina (0,2%) hanno richiesto solo se le cellule derivate da colture di cellule neurali adulte.
- 25μL di sospensione cellulare (di 2,2 x 10 5 cellule / ml cellule da neurosfere dissociati o 6,5 x 10 5 cellule / ml cellule primarie da dissociato tessuto del SNC). Nota: I numeri di cellulare placcato finale dovrebbe essere circa 2500 cellule per 35 millimetri piatto cultura per neurosfere cellule derivate e 7500 cellule per 35 mm per piatto cultura cellule primarie. In alcuni casi, la densità finale delle cellule placcatura deve essere regolato eseguendo un esperimento di titolazione delle cellule. Per le analisi statistiche, il numero totale di colonie rilevate dopo 21 giorni di cultura dovrebbe essere entro l'intervallo di almeno 50-150 colonie.
- Il mezzo che contiene le cellule si mescola delicatamente e poi 1,3 mL di soluzione di collagene freddo è trasferito alla sospensione cellulare e mescolato bene pipettando delicato per evitare l'introduzione di eventuali bolle.
- La soluzione mista è dispensato al centro di ogni piatto cultura 35mm (~ 1,5 ml / piatto) ei piatti sono punta delicatamente con un movimento circolare per lasciare che la miscela diffuse uniformemente sulla superficie del piatto. .
- Il duplicato 35 piatti cultura mm sono poste in un piatto di 100 mm Petri. Il coperchio del piatto nuovo 35 mm è rimosso e il piatto è aperto anche messo nel piatto stessi 100 millimetri Petri. Acqua sterile viene aggiunto a questo open piatto 35 mm a mantenere l'umidità ottimale durante il periodo di incubazione. Piastre di test biologico piazza (245 mm) vengono utilizzati quando più replicare piatti 35 mm sono stati istituiti. Ancora una volta, comprendono 2 o 3 piatti aperta 35 mm contenente acqua sterile.
- Le piastre sono trasferiti in un incubatore a 37 ° C, 5% di CO2 e il 95% di umidità. Il rapprende collagene da aumento della temperatura e la formazione di gel avverrà entro circa un'ora. Le culture non deve essere disturbato durante questo periodo.
- Cellule coltivate vengono incubate per 21 giorni (differenze di dimensioni della colonia può essere chiaramente distinta dopo 21 giorni).
4. Preparazione media di ricarica e di alimentazione della Cultura:
Come N-ACCP culture vengono incubate per un lungo periodo di tempo (21 giorni), le colture devono essere alimentati con il NeuroCult appropriato completo medio di riempimento preparato fresco come segue:
- 4,5 ml di Medium NeuroCult NSC basale è mescolato con 0,5 mL di NeuroCult NSC Supplementi proliferazione e poi i fattori di crescita si aggiunge:
- 250 microlitri di 10μg/mL EGF (per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mg / ml FEG)
- 125 ml di 10μg/mL b-FGF (per ottenere una concentrazione finale di 0.25μg/mL b-FGF) richiesto solo se le cellule derivate da colture di cellule neurali adulte.
- 125 ml di eparina 0,2%, necessario solo se le cellule derivate da colture di cellule neurali adulte.
- 60 ml di Medium appropriato completa Replenishment NeuroCult (per le cellule embrionali o adulte) viene aggiunto al centro di ogni piatto saggio NCFC una volta ogni 7 giorni durante l'incubazione intero NCFC cultura Assay (21 giorni).
5. Punteggio N-CFC Colonie Assay derivati e calcolo della frequenza di bona fide NSCs e cellule progenitrici neurali:
- Ogni piatto 35 mm è la cultura messo su un piatto punteggio griglia con la dimensione della griglia di 2,0 mm x 2,0 mm e poi entrambi i piatti sono immessi sul palco microscopio.
- Utilizzando bassa potenza (2.5X - 5X) lente dell'obiettivo, ogni piatto viene sottoposto a scansione e le colonie sono segnati in base alle loro dimensioni.
- Le colonie sono classificati in due categorie principali:
- Meno di 2 mm di diametro
- ≥ 2 mm di diametro
6. Rappresentante dei risultati:
Come in test neurosfere, le cellule placcato in N-CFC test iniziano a proliferare e fare piccole colonie di cellule entro 3 - 7 giorni dopo la placcatura (Figura 1). Tra due settimane, le colonie di diverse dimensioni si possono distinguere. Mentre la maggior parte delle colonie tendono a smettere di crescere dopo 14 giorni, alcune colonie continuano a crescere di dimensione. Dopo 21 giorni, le colonie possono essere classificati in una delle quattro categorie: 1) meno di 0,5 mm di diametro, 2) 0.5 - 1 mm di diametro, 3) 1 - 2 mm di diametro e 4) ≥ 2 mm di diametro. In pratica, le colonie di dimensioni inferiori a 2 mm di diametro sono indicati come progenitrici derivate (Figura 2) e colonie ≥ 2 millimetri di diametro sono indicati come NSC derivati (Figura 3). Il numero di colonie ≥ 2 millimetri di diametro per cellule totali placcato, rappresenta la frequenza del reale in buona fede le cellule staminali neurali a lungo termine di auto-rinnovamento e multi-potenziali capacità. Le neurosfere totale formando frequenza in una popolazione di cellule particolare dopo 7-8 giorni in un esperimento parallelo NSA è stata stimata essere simile al totale delle colonie che formano la frequenza della popolazione stessa cella dopo 21 giorni in un N-ACCP esperimento. L'N-ACCP tuttavia, costituisce una condizione più permissivo in modo che ogni cellula può mostrare tutto il suo potenziale proliferativo.
| Componente | 2 si replica | 3 repliche | 4 repliche |
| NeuroCult NCFC mezzo privo di siero senza Citochine | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult NSC proliferazione Supplementi | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 mg / ml) | 6,6 | 9,9 | 13,2 |
| bFGF (10 mg / ml), solo per le cellule adulte | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Soluzione di eparina (0,2%), solo per le cellule adulte | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Penicillina / streptomicina (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| Celle a: 2,2 x 10 5 colture di cellule / ml O 6,5 x 10 5 cellule primarie / mL | 25 | 37,5 | 50 |
| Collagene Soluzione | 1300 | 1950 | 2600 |
Tabella 1. Componenti di completo N-CFC cultura test.
Figura 1. Colonie Rappresentante in N-ACCP cultura di passaggio uno E14 NSCs del mouse 7 giorni dalla placcatura. Le colonie potrebbe visualizzare la morfologia e dimensioni diverse. Originale ingrandimento; 4x
Figura 2. Colonie progenitrici derivate rappresentante di diverse dimensioni in N-ACCP cultura di passaggio del mouse uno E14 NSCs 21 giorni dopo placcatura. Come si vede, le colonie hanno una morfologia diversa, ma tutti sono 2 mm in meno di dimensione. Originale ingrandimento; 4x
Rappresentante Figura 3. Bona fide di cellule staminali derivate colonia in N-ACCP cultura di passaggio del mouse uno E14 NSCs 21 giorni dopo placcatura. Colonie di cellule staminali potrebbe visualizzare diversa morfologia (vediil video) ma tutti sono ≥ 2 millimetri di diametro. Originale ingrandimento; 4x
Discussion
Sebbene saggio neurosfere 3,1,2 è il metodo più comune per isolare ed espandere cellule staminali neurali da una varietà di fonti come adulto che embrionale del tessuto nervoso centrale, non può misurare con precisione la frequenza di NSC in una popolazione mista di cellule precursori neurali (staminali e progenitori), come non c'è una relazione uno a uno tra il numero di neurosfere e il numero di cellule staminali in buona fede 4. Per far fronte a questa limitazione, l'originale NSA è stato adattato in modo da consentire il staminali neurali e cellule progenitrici di crescere la loro capacità di proliferazione pieno per tre settimane 5-7. A differenza del liquido NSA, in N-ACCP le colonie sono in realtà clonale derivati, come il semi-solida matrice di collagene impedisce la migrazione delle cellule singole placcato e l'aggregazione delle colonie. Per ottenere risultati coerenti con questa analisi si consiglia:
- Garantire una sospensione singola cella della sospensione cellulare originale. Far passare la sospensione singola cellula con un 40-micron di dimensioni filtro a rete in modo da eliminare non dissociati grumi.
- Conservare la soluzione di collagene su ghiaccio o in frigorifero C ° +4. Il collagene è l'ultimo elemento da aggiungere alla miscela di sospensione cellulare come si congela aumentando la temperatura.
- Non dimenticare di alimentare la cultura ogni settimana. Aggiunta del supporto di rifornimento che contiene il fattore di crescita (s) una volta ogni 7 giorni permette alle cellule di continuare a proliferare nel lungo periodo la cultura.
- La densità finale delle cellule placcatura sono stati ottimizzati per le cellule derivate da cellule neurali primarie o coltivate in modo che il numero totale di colonie rilevate dopo 21 giorni di cultura nel NCFC-A è nel range di almeno 50-200 colonie. Questa gamma permette di individuare le rare colonie NSC derivati> 2mm di diametro, in campioni, fornendo un numero sufficiente di colonie per analisi statistiche. A seconda della sorgente di cellule di partenza, un numero significativamente inferiore (<50) e un numero maggiore di colonie (> 250) sono a volte ottenuti. Colonie troppo pochi comporterà l'> colonie 2mm di diametro al di sotto dei livelli di rilevamento, mentre le colonie troppi si tradurrà in anddepletion sovraffollamento dei componenti mezzo di crescita con un conseguente conteggio delle colonie inesatte. Pertanto la densità delle cellule placcatura dovranno essere adeguati di conseguenza (cioè aumentando o diminuendo il numero totale di cellule placcato)
Disclosures
Uno degli autori, Louis A. Sharon, è affiliata con StemCell Technologies Inc, produttore di alcuni reagenti usati in questo studio.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
