Summary
Dieses Video-Protokoll zeigt, wie zu diskriminieren und aufzählen bona fide neurale Stammzellen in einer gemischten Population von neuralen Vorläuferzellen über die neuronalen Kolonie-bildenden-Zell-Assay.
Abstract
Die Neurosphäre Assay (NSA) ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zu isolieren, zu erweitern und auch die Berechnung der Häufigkeit von neuralen Stammzellen (NSCs). Darüber hinaus hat diese serumfreien System auch eingesetzt worden, um Stammzellen zu erweitern und festzustellen, deren Häufigkeit aus einer Vielzahl von Tumoren und normalem Gewebe. Es wurde vor kurzem, dass eine Eins-zu-eins-Beziehung nicht zwischen Neurosphäre Bildung und NSCs bestehen gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass die NSA, wie sie derzeit angewendet wird, die Häufigkeit der NSCs überschätzt in einer gemischten Population von neuronalen Vorläuferzellen sowohl aus der embryonalen und adulten Gehirn von Säugetieren isoliert. Dieses Video zeigt praktisch eine neue Basis von Kollagen halbfeste Assay, der Neural-Kolonie-bildenden-Zell-Assay (N-EUFA), die die Fähigkeit, stammen aus Vorläuferzellen unterscheiden auf der Grundlage ihrer langfristigen proliferative Potential hat, und stellt somit ein Verfahren aufzuzählen NSC Frequenz. In der N-EUFA werden die Kolonien ≥ 2 mm im Durchmesser von Zellen, die alle funktionalen Kriterien eines NSC treffen abgeleitet, während Kolonien <2mm aus Vorläuferzellen abgeleitet werden. Die N-EUFA Verfahren kann für Zellen, die aus unterschiedlichen Quellen, einschließlich Primär-und kultivierten adulten oder embryonalen Maus-ZNS-Zellen hergestellt werden. Hier verwenden wir Zellen aus Passage vorbereiteten Neurosphären aus embryonalen Tag 14 Mäuse Gehirn erzeugt werden, um N-EUFA durchzuführen. Die Kulturen werden mit Proliferationsmedium alle sieben Tage für drei Wochen wieder aufgefüllt, damit der plattierten Zellen, um ihre volle proliferative Potential aufweisen und dann die Frequenz der neuronalen Vorläuferzellen und bona fide neuralen Stammzellen ist jeweils durch Zählen der Anzahl der Kolonien, die <2mm berechnet und diejenigen, die ≥ 2mm sind in Bezug auf die Anzahl der Zellen, die ursprünglich vergoldet waren.
Protocol
1. Elemente, die Be Prepared bevor Sie fortfahren to Cell Plating Need:
- Entsprechende Volumen der kompletten NSC Medium wird hergestellt, indem NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Supplements bei einem 9:1-Verhältnis, bzw. vorbereitet.
- Ein Aliquot NeuroCult NCFC Serum-freiem Medium ohne Zytokine ist aufgetaut.
- Das Medium wird in einem 37 ° C Wasserbad erwärmt.
- Stammlösungen von epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF) in einer Konzentration von 10 ug / ml und Heparin bei 0,2% voraus sind vorbereitet.
- Je nach Experiment Größe, sind mehrere 35-mm-Gewebe-Kulturschalen auf den Teller der Zellen und einer 150-200cm Kunststoff-Petrischale ist auch nötig, um die doppelte 35mm Gerichte halten und eine dritte 35-mm-Schale für Wasser benötigt.
2. Cell Preparation:
Abhängig von Ihrem Experiment, können die Zellen von einem erwachsenen und embryonalen Quelle (primäre dissoziierten Gewebe oder dissoziiert Neurosphären) hergestellt werden. Dissect Gewebe von Erwachsenen / embryonalen Maus des zentralen Nervensystems (ZNS) oder distanzieren Erwachsene / embryonaler-derived Neurosphären nach wie vor 1,2 und dann beschrieben:
- Die einzigen Zellsuspension durch ein 40-um-size-Sieb-Filter geleitet wird, um so zu entfernen, nicht getrennten Klumpen.
- 10 &mgr; l der Zellsuspension mit 90μl des Trypanblau auf eine Zellzahl führen gemischt. Hinweis: Andere geeignete Zelle Verdünnungen können auch verwendet werden.
- Bei der Verwendung von primären embryonalen oder adulten abgeleitete neurale Zellen, verdünnte die Zellsuspension auf eine Konzentration von 6,5 x 10 5 Zellen / ml in kompletten NSC Medium. Bei der Verwendung von Zellen aus dissoziierten Neurosphären aus adulten oder embryonalen neuronalen Zellen abgeleitet, verdünnte die Zellsuspension auf eine Konzentration von 2,2 x 10 5 Zellen / ml in kompletten NSC Medium.
3. Plating Cells in Halbfeste N-EUFA Medium:
- Das entsprechende Volumen aus den folgenden Komponenten in Ordnung ist gemischt, je nach Anzahl der Wiederholungen. Hier mischen wir den Betrag für zwei Bedarf repliziert oder doppelte Gerichte. Weitere Zahlen der Wiederholungen, siehe Tabelle 1.
- 1,7 ml NeuroCult NCFC Serum-freiem Medium ohne Zytokine
- 330 ul der NeuroCult NSC Proliferation Supplements
- 6,6 ul des EGF (10μg/mL)
- 32 ul von Penicillin / Streptomycin
- 3,3 ul der b-FGF (10μg/mL) nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen.
- 3,3 ul von Heparin (0,2%) nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen.
- 25 &mgr; l der Zellsuspension (von 2,2 x 10 5 Zellen / ml Zellen aus dissoziierten Neurosphären oder 6,5 x 10 5 Zellen / ml primären Zellen aus dissoziierten ZNS-Gewebe). Hinweis: Die endgültige Anzahl der Zellen überzogen sollte etwa 2500 Zellen pro 35 mm Kulturschale werden für Neurosphäre abgeleiteten Zellen und 7500 Zellen pro 35 mm Kulturschale für Primärzellen. In einigen Fällen hat die letzte Zelle Plattierungsdichte auf, indem Sie eine Zelle Titration eingestellt werden. 150 Kolonien - Für statistische Analysen sollten die Gesamtzahl der Kolonien nach 21 Tagen der Kultur erkannt im Bereich von mindestens 50 sein.
- Das Medium mit den Zellen ist sanft und dann 1,3 ml kaltem Collagen-Lösung zur Zellsuspension übertragen und auch durch vorsichtiges Pipettieren gemischt, um zu vermeiden Einführung von Luftblasen gemischt.
- Die gemischte Lösung wird in die Mitte eines jeden 35mm Kulturschale (~ 1,5 ml / Schale) verzichtet und die Gerichte sind kippte vorsichtig mit kreisenden Bewegungen, damit die Mischung gleichmäßig verteilt über die Oberfläche der Schale. .
- Die doppelte 35 mm Kulturschalen werden in eine 100 mm Petrischale gelegt. Der Deckel des neuen 35 mm Schale wird entfernt und die offene Schale ist auch in der gleichen 100 mm Petrischale. Sterilem Wasser ist zu dieser offenen 35 mm Schale zugegeben, um eine optimale Luftfeuchtigkeit während der Inkubationszeit zu halten. Platz Bioassay-Platten (245 mm) verwendet werden, wenn mehr replizieren 35 mm Gerichte eingerichtet wurden. Auch hier sind 2 oder 3 offen 35 mm Schalen mit sterilem Wasser.
- Die Platten sind in einen Inkubator gesetzt bei 37 übertragen ° C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit. Das Kollagen gerinnt durch steigende Temperatur und Gelbildung wird innerhalb etwa einer Stunde auftreten. Die Kulturen sind während dieser Zeit nicht gestört werden.
- Kultivierte Zellen werden für 21 Tage (Unterschiede in Koloniegröße deutlich nach 21 Tagen zu unterscheiden) inkubiert.
4. Vorbereitung Replenishment Medium und Fütterung der Kultur:
Als N-EUFA Kulturen über einen längeren Zeitraum (21 Tage) bebrütet werden, sollten Kulturen mit den entsprechenden vollständigen NeuroCult zugeführt werden Nachschub Medium frisch zubereitet wie folgt:
- 4,5 ml NeuroCult NSC Basal Medium mit 0,5 m gemischtL von NeuroCult NSC Proliferation Supplements und dann die Wachstumsfaktoren wird angefügt:
- 250 ul 10μg/mL EGF (bis zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml EGF zu geben)
- 125 ul 10μg/mL b-FGF (bis zu einer Endkonzentration von 0.25μg/mL b-FGF geben) nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen.
- 125 ul 0,2% Heparin, nur erforderlich, wenn die Kultivierung von Zellen aus adulten neuralen Zellen.
- 60 ul der entsprechenden vollständigen NeuroCult Replenishment Medium (für embryonale oder adulte Zellen) in der Mitte jedes NCFC Assay Schüssel einmal alle 7 Tage während der gesamten NCFC Assay Kultur Inkubation (21 Tage) aufgenommen.
5. Scoring N-CFC-Assay Derived Kolonien und Berechnung der Häufigkeit der Bona-fide-NSCs und neuronale Vorläuferzellen:
- Jede 35 mm Kulturschale befindet sich auf einem gerasterten Scoring Schale mit dem Rastermaß von 2,0 mm x 2,0 mm gelegt und dann beide Gerichte werden auf dem Mikroskoptisch platziert.
- Mit Low-Power-(2.5x - 5x) Objektiv, jedes Gericht wird gescannt und die Kolonien sind aufgrund ihrer Größe erzielt.
- Die Kolonien sind in zwei große Kategorien eingeteilt:
- Weniger als 2 mm Durchmesser
- ≥ 2 mm Durchmesser
6. Repräsentative Ergebnisse:
Wie in Neurosphäre Test starten Zellen in N-CFC-Assay vernickelt sich zu vermehren und bilden kleine Kolonien von Zellen innerhalb von 3 bis 7 Tage nach dem Ausplattieren (Abbildung 1). In zwei Wochen kann Kolonien unterschiedlicher Größe unterschieden werden. Während die Mehrheit der Kolonien wachsen zu stoppen nach 14 Tagen neigen, weiterhin einige Kolonien an Größe zunehmen. Am Tag 21, Kolonien in einer der vier Kategorien eingeteilt werden: 1) weniger als 0,5 mm Durchmesser, 2) von 0,5 bis 1 mm Durchmesser, 3) 1 bis 2 mm Durchmesser und 4) ≥ 2mm im Durchmesser. Praktisch werden die Kolonien kleiner als 2 mm Durchmesser bezeichnet als Stammvater abgeleitet (Abbildung 2) und Kolonien ≥ 2mm im Durchmesser sind, bezeichnet als NSC abgeleitet (Abbildung 3). Die Anzahl der Kolonien ≥ 2mm im Durchmesser pro insgesamt Zellen ausplattiert, stellt die Häufigkeit der tatsächlichen bona fide neurale Stammzellen mit langfristiger Selbst-Erneuerung und Multi-Potential-Funktionen. Die gesamte Neurosphäre bilden Frequenz in einer bestimmten Zellpopulation nach 7-8 Tag in einem parallel NSA Experiment wurde geschätzt, ähnlich zu sein, die gesamte Kolonie bildende Frequenz der gleichen Zellpopulation nach 21 Tagen in einem N-EUFA Experiment. Die N-EUFA bietet jedoch eine weniger restriktive Bedingungen, so dass jede Zelle kann ihre volle proliferative Potenzial zu zeigen.
| Komponente | 2 Wiederholungen | 3 Wiederholungen | 4 Wiederholungen |
| NeuroCult NCFC Serum-freiem Medium ohne Zytokine | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 ug / mL) | 6,6 | 9,9 | 13,2 |
| bFGF (10 ug / mL), nur für erwachsene Zellen | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Heparin-Lösung (0,2%), nur für erwachsene Zellen | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Penicillin / Streptomycin (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| Cells unter: 2,2 x 10 5 kultivierten Zellen / ml oder 6,5 x 10 5 primären Zellen / ml | 25 | 37,5 | 50 |
| Kollagenlösung | 1300 | 1950 | 2600 |
Tabelle 1. Komponenten einer kompletten N-CFC-Assay Kultur.
Abbildung 1. Representative Kolonien in N-EUFA Kultur der Gang sind E14-Maus NSCs 7 Tage nach dem Ausplattieren. Die Kolonien zeigt möglicherweise unterschiedlicher Morphologie und Größe. Original-Vergrößerung; 4x
Abbildung 2. Representative Vorläuferzellen abgeleitet Kolonien unterschiedlicher Größe in N-EUFA Kultur der Gang sind E14-Maus NSCs 21 Tage nach dem Ausplattieren. Wie gezeigt, haben die Kolonien unterschiedlicher Morphologie, aber alle sind weniger 2 mm groß. Original-Vergrößerung; 4x
Abbildung 3. Representative bona fide Stammzellen abgeleitete Kolonie in N-EUFA Kultur der Gang sind E14-Maus NSCs 21 Tage nach dem Ausplattieren. Aus embryonalen Stammzellen Kolonien zeigt möglicherweise unterschiedliche Morphologie (siehedas video), aber alle sind ≥ 2mm im Durchmesser. Original-Vergrößerung; 4x
Discussion
Obwohl Neurosphäre Assay 3,1,2 ist die häufigste Methode, um zu isolieren und zu erweitern neuralen Stammzellen aus einer Vielzahl von Quellen wie adulten und embryonalen ZNS-Gewebe, kann es nicht genau messen die NSC-Frequenz in einer gemischten Population von neuronalen Vorläuferzellen (Stammzellen und Vorläuferzellen), da es keine 0.59 Beziehung zwischen der Anzahl der Neurosphären und die Anzahl der bona fide Stammzellen Zellen 4. Um diese Einschränkung ist die ursprüngliche NSA worden, um damit die neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, um ihr volles Verbreitung Kapazität für 3 Wochen 5-7 wachsen angepasst. Im Gegensatz zu den flüssigen NSA, in der N-EUFA die Kolonien sind eigentlich klonal abgeleitet, wie die halbfeste Kollagenmatrix verhindert die Migration der einzelnen Zellen ausplattiert und Aggregation von Kolonien. Für konsistente Ergebnisse mit diesem Test empfehlen wir:
- Stellen Sie sicher, eine einzige Zellsuspension in der ursprünglichen Zellsuspension. Fahren Sie mit dem einzigen Zellsuspension durch ein 40-um-size-Sieb-Filter, so dass nicht-dissoziierten Klumpen zu entfernen.
- Halten Sie die Kollagen-Lösung auf Eis oder in den +4 ° C Kühlschrank. Kollagen ist das letzte Element, um die Mischung der Zellsuspension hinzugefügt werden, da es durch Erhöhung der Temperatur erstarrt.
- Vergessen Sie nicht, die Kultur-Feeds jede Woche. Hinzufügen der Nachschub-Medium mit Wachstumsfaktor (s) einmal alle 7 Tage wird es Zellen weiter zu wuchern über den erweiterten Kultur Periode.
- Die letzte Zelle Plattierungsdichte haben Zellen aus primären oder kultivierten neuronalen Zellen abgeleitet wurden so optimiert, dass die Gesamtzahl der Kolonien nach 21 Tagen der Kultur in der festgestellt NCFC-A liegt im Bereich von mindestens 50 bis 200 Kolonien. Dieser Bereich ermöglicht die Erkennung der seltenen NSC abgeleitet Kolonien> 2mm im Durchmesser in Proben, während die Bereitstellung einer ausreichenden Zahl von Kolonien für statistische Auswertungen. Je nach Ausgangsmaterial Zelle Quelle, deutlich weniger (<50) und eine höhere Anzahl von Kolonien (> 250) sind manchmal erhalten. Zu wenige Kolonien in den Kolonien> 2mm im Durchmesser unterhalb Erfassungsebenen führen, während zu viele Kolonien in Überbelegung anddepletion Wachstumsmedium Komponenten und somit eine ungenaue Koloniezählung führen wird. Deshalb Zelle Plattierungsdichte müssen entsprechend angepasst werden (zB Erhöhung oder Verringerung der Gesamtzahl der Zellen vernickelt)
Disclosures
Einer der Autoren, Sharon A. Louis, ist mit StemCell Technologies Inc, einem Hersteller von einigen Reagenzien in dieser Studie verwendeten angeschlossen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Overstreet Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
