Summary
このビデオプロトコルは、神経コロニー形成細胞アッセイを用いて神経前駆細胞の混合集団で善意の神経幹細胞を区別して列挙する方法を示しています。
Abstract
ニューロスアッセイ（NSA）は、分離拡大し、また、神経幹細胞（NSC）の周波数を計算するために最も頻繁に使用される方法の1つです。また、この無血清培養システムは、幹細胞を拡大し、腫瘍と正常組織のさまざまなから自分の周波数を決定するために採用されている。それは一対一の関係はニューロスフェアの形成とNSCの間に存在していないことが最近示されている。これはNSAとして現在適用されているが、胚と成体哺乳類の脳の両方から分離された神経前駆細胞の混合集団でNSCの頻度を過大評価することを示唆している。このビデオでは、実質的に半固形アッセイ、彼らの長期的な増殖能に基づいて、前駆細胞から幹細胞を識別する能力を持つニューラルコロニー形成細胞アッセイ（N -シミュレーションプロジェクト）を、考慮した、全く新しいコラーゲンを示し、そのための方法を提供するNSCの周波数を列挙する。コロニーが<2ミリメートルの前駆細胞から派生している間、N -シミュレーションプロジェクトでは、直径のコロニー≥2 mmを、NSCのすべての機能の基準を満たす細胞から派生しています。 N -シミュレーションプロジェクトの手順は、プライマリおよび培養成体または胎児マウスの中枢神経系の細胞を含むさまざまなソースから調製した細胞に使用することができます。ここでは、通路からN -シミュレーションプロジェクトを実行するために胚性14日目マウスの脳から生成されたニューロスフェアを準備セルを使用してください。培養は、播種した細胞がその完全な増殖能を示すことができるように、増殖培地で3週間、7日ごとに補充されていますし、神経前駆細胞と善意の神経幹細胞の頻度は、<2ミリメートルであるコロニーの数をカウントすることで、それぞれ計算されます。と≥2ミリメートルが最初に播種した細胞の数を参照しているもの。
Protocol
1。細胞のプレーティングに進む前に準備が必要な項目：
- 完全なNSC媒体の適切な量はそれぞれ、9:1の比率でNeuroCult NSC基礎培地とNeuroCult NSC増殖サプリメントを混合して調製される。
- サイトカインなしNeuroCult NCFC無血清培地のアリコートを解凍しています。
- 培地は37℃の水浴で暖めています。
- 0.2％の10μg/ mLのとヘパリンの濃度で上皮成長因子（EGF）、基本的な線維芽細胞成長因子（β- FGF）のストック溶液は、先に用意されています。
- 実験のサイズに応じて、いくつかの35ミリメートルの組織培養皿、プレート、細胞一150〜200センチメートルプラスチックシャーレにも重複して35ミリメートル皿を保持するために必要とされており、水のためのサード35mmディッシュに必要とされる。
2。細胞の準備：
あなたの実験に応じて、細胞は、成体または胎児ソース（主に解離組織または解離ニューロスフェア）から調製することができる。大人/マウス胎児中枢神経系（CNS）から組織を細かく分析またはその後1,2の前に説明したとのように成人/胚由来のニューロスフェアを解離する。
- 単一の細胞懸濁液は、非解離塊を除去するために、40μmのサイズのメッシュフィルターを通過させる。
- 細胞懸濁液の10μlをは、細胞数を数えるために、トリパンブルーの90μlと混合し、 注 ：他の適切な細胞の希釈液を使用することもできます。
- 一次胚や成体由来の神経細胞を用いた場合、完全なNSCの培地で6.5 × 10 5細胞/ mLの濃度に細胞懸濁液を希釈する。成人または胎児の神経細胞に由来する解離ニューロスフェアから細胞を使用する場合は、完全なNSCの培地で2.2 × 10 5細胞/ mLの濃度に細胞懸濁液を希釈する。
3。半固体のN -シミュレーションプロジェクトの培地で細胞をメッキ：
- 次のコンポーネントの適切な量は、複製の数に応じて、順番に混合される。ここでは二つの複製や皿を複製するために必要な量を混ぜる。複製の追加の番号については、 表1を参照してください。
- サイトカインなしNeuroCult NCFC無血清培地1.7 mLを
- NeuroCult NSC増殖サプリメント330μL
- EGFの6.6μL（10μg/mL）
- ペニシリン/ストレプトマイシンの32μL
- B - FGF（10μg/mL）3.3μLの培養細胞は成体神経細胞由来の場合にのみ必要です。
- ヘパリン（0.2％）3.3μLの培養細胞は成体神経細胞由来の場合にのみ必要です。
- 細胞懸濁液の25μlの（解離ニューロスフェアまたは解離CNS組織から6.5 × 10 5細胞/ mLの初代細胞から2.2 × 10 5細胞/ mLの細胞の） 注 ：播種、最終的な細胞数が35 mmの培養皿当たり約2500細胞でなければならないニューロスフェア由来細胞および初代培養細胞を35 mmの培養皿当たり7500細胞のための。いくつかのケースでは、最終的な細胞の播種密度は細胞の滴定実験を行うことにより調整する必要があります。 150コロニー - 統計分析のために、文化の21日後に検出されたコロニーの総数は少なくとも50の範囲内でなければなりません。
- 細胞を含む培地を穏やかに混合され、コールドコラーゲン溶液の後、1.3mlの細胞懸濁液に移して、任意の気泡を導入しないように穏やかなピペッティングによりよく混合する。
- この混合溶液を各35ミリメートルの培養皿（〜1.5 mLの/皿）の中心に分注していると料理を穏やかに混合物は、皿の表面に均等に分散させるために円形の動きを使ってチップを渡したされています。 。
- 重複した35mmの培養皿を100mmペトリ皿に入れられます。新しい35mm皿のふたが除去され、オープン皿も同じ100ミリメートルペトリ皿に配置されます。滅菌水は、潜伏期間中に最適な湿度を維持するために、このオープン35mm皿に追加されます。正方形のバイオアッセイプレート（245 mm）をより多くの複製35mmディッシュが設定されている場合に使用されています。再び、滅菌水を含む2つまたは3つのオープン35mmディッシュが含まれています。
- プレートを37℃インキュベーターにセットして転送される° C、5％CO2、湿度95％。温度の上昇やゲル形成によるコラーゲンは固まるには約1時間以内に発生します。培養物は、この時間の間乱されるべきではない。
- 培養細胞は21日（コロニーの大きさの違いが明確に21日後に区別することができる）インキュベートする。
4。補充培地を準備し、文化を食べさせる。
N -シミュレーションプロジェクトの文化が長期間（21日間）インキュベートされているように、培養物を、適切な完全なNeuroCultを供給する必要がある 補充培地は、次のように新しく調製：
- NeuroCult NSC基礎培地4.5 mLを0.5メートルと混合され、NeuroCult NSC増殖サプリメントとその後の成長因子のLが追加されます。
- 10μg/mLEGFの250μL（0.5μg/ mLのEGFの最終濃度を与えるために）
- 10μg/mLB - FGF（0.25μg/mLB - FGFの最終濃度を与えるために）、125μLの培養細胞は成体神経細胞由来の場合にのみ必要です 。
- 0.2％ヘパリンの125μLは、 培養細胞は成体神経細胞由来の場合にのみ必要です 。
- 適切な完全なNeuroCult補充培地（胚、大人の細胞のための）60μLを全体NCFCアッセイ培養インキュベーション（21日）中に7日ごとに一回、各NCFCアッセイ皿の中央に追加されます。
5。 N - CFCアッセイ由来のコロニーをスコアリングし、 善意のNSCと神経前駆細胞の頻度を計算する：
- 各35mmの培養皿は、2.0ミリメートル× 2.0 mmのグリッドサイズとグリッド得点皿上に配置され、その後、両方の皿は、顕微鏡ステージ上に配置されています。
- 低消費電力を（2.5倍 - 5X）を使用して、対物レンズ、各皿がスキャンされ、コロニーは、そのサイズに基づいて採点されます。
- コロニーは2つの主要カテゴリに分類されます。
- 直径2mm未満
- ≥直径2mm
6。代表的な結果：
めっき後の7日間（図1） - ニューロスアッセイと同様に、N - CFCアッセイで播種細胞が増殖し、3内の細胞の小さなコロニーを作り始める。 2週間後に、異なるサイズのコロニーを区別することができます。コロニーの大半は14日後に成長を停止する傾向がある一方で、いくつかのコロニーのサイズが増加し続ける。 1mmの直径、3）1 - - 2 mmの直径と4）≥2ミリメートル、直径0.5mm未満の直径、2）0.5）：1日21で、コロニーが4つのカテゴリのいずれかに分類することができます。実質的に、2mmの直径よりも小さいコロニーが派生前駆と呼ばれます（図2）とNSCの派生として、直径コロニー≥2ミリメートルは（図3）と呼ばれます。メッキの総細胞あたりの直径はコロニー≥2mmの数は、長期の自己再生およびマルチ潜在的な能力を持つ実際の善意の神経幹細胞の頻度を表します。並列NSAの実験7-8日後に特定の細胞集団の頻度を構成する総ニューロスフェアは、N -シミュレーションプロジェクトの実験で21日後に同じ細胞集団の頻度を構成する総コロニーに類似すると推定されている。 N -シミュレーションプロジェクトでは、しかし、各セルは、その完全な増殖能を示すことができるように、より寛容な条件を提供します。
| コンポーネント | 2は、複製 | 図3は、複製 | 4複製 |
| NeuroCult NCFCサイトカインのない無血清培地 | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult NSC増殖サプリメント | 330 | 495 | 660 |
| EGF（10μg/ mL）を | 6.6 | 9.9 | 13.2 |
| 唯一の大人の細胞のためのbFGF（10μg/ mL）を、 | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| 唯一の大人の細胞のためのヘパリン溶液（0.2％）、 | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン（1:100） | 32 | 48 | 64 |
| で細胞： 2.2 × 10 5の培養細胞/ mLまたは 6.5 × 10 5一次細胞/ mLの | 25 | 37.5 | 50 |
| コラーゲン溶液 | 1300 | 1950 | 2600 |
表1。完全なN - CFCアッセイの文化のコンポーネント。
図1の通路のN -シミュレーションプロジェクトの文化の代表コロニーone E14マウスのNSCの7日間めっき後。コロニーは、さまざまな形態とサイズが表示される場合があります。オリジナルの倍率; 4倍
図2の通路のN -シミュレーションプロジェクトの文化の異なるサイズ21日メッキ相次いE14マウスのNSCの代表前駆細胞由来のコロニー。図に示すように、コロニーは異なる形態を持っていますが、すべてのサイズは2未満mmである。オリジナルの倍率; 4倍
通過のN -シミュレーションプロジェクトの文化one E14マウスのNSCの21日めっき後にコロニー由来の図3。代表善意の幹細胞。幹細胞由来のコロニーは、（参照は異なる形態が表示されることがあります。ビデオ）が、すべては、直径≥2ミリメートルです。オリジナルの倍率; 4倍
Discussion
ニューロスフェアの検定3,1,2は、大人と胚中枢神経系の組織のようなさまざまなソースからの神経幹細胞を分離し、拡大する最も一般的な方法ですが、それは正確に神経前駆細胞（幹細胞の混合集団でNSCの周波数を測定することができないとニューロスフェアの数と善意の幹細胞の数は4との間の一対一の対応関係がないとして前駆細胞）。この制限に対処するため、元NSAは、神経幹細胞および前駆細胞5-7三週間、完全な増殖能に成長させるように適応されています。半固体コラーゲンマトリックスは、コロニーのメッキと凝集単一細胞の遊走を妨げるとして液体NSAとは異なり、N -シミュレーションプロジェクトではコロニーは実際にクローン的、派生しています。このアッセイで一貫性のある結果を得るためにお勧め：
- オリジナルの細胞懸濁液に単一の細胞懸濁液を確認してください。非解離塊を除去するために、40μmのサイズのメッシュフィルターを通過して、単一の細胞懸濁液を渡します。
- 氷の上または+4℃の冷蔵庫内のコラーゲン溶液を保管してください。コラーゲンは、温度を上昇させることにより固まるように細胞懸濁液の混合物に追加される最後の項目です。
- 毎週の文化を供給することを忘れないでください。 7日ごとに一度成長因子（s）を含む補充培地を追加すると、細胞が拡張された培養期間にわたって増殖させ続けることが可能となります。
- 最終的な細胞播種密度は、プライマリまたは培養神経細胞由来の細胞用に最適化されているように文化の21日後に検出されたコロニーの総数NCFC -少なくとも50の範囲内にある - 200個のコロニー。統計分析のためのコロニーの十分な数字を提供しながら、この範囲は、試料の直径は珍しいNSC由来のコロニー> 2mmの検出を可能にする。開始セルのソースに応じて、有意に少なかった（<50）とコロニーの高い数字が（> 250）時に得られる。あまりにも多くのコロニーは、不正確なコロニー計数の結果、増殖培地の成分の過密anddepletionをもたらす間、少なすぎるのコロニーは、直径が検出レベル以下であることで植民地> 2ミリメートルになります。したがって、細胞播種密度は（すなわち、細胞メッキの合計数を増加または減少）に応じて調整する必要があります。
Disclosures
著者の一人、シャロンA.ルイは、StemCellテクノロジーズ株式会社、本研究で使用されるいくつかの試薬の生産者と提携しています。
Acknowledgments
この作品は、オーバストリート財団からの資金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
