Summary
Это видео демонстрирует, как протокол к дискриминации и перечислить добросовестных нервные стволовые клетки в смешанной популяции нейронных клеток-предшественников помощью нейронных колониеобразующих ячейки анализа.
Abstract
Neurosphere анализа (АНБ) является одним из наиболее часто используемые методы для изоляции, расширение и рассчитать частоты нейронных стволовых клеток (NSCs). Кроме того, это бессывороточной культуре система была также использована для расширения стволовых клеток и определить их частоты от различных опухолей и нормальных тканей. Было показано, что недавно один-к-одному не существует между neurosphere формирования и NSCs. Это говорит о том, что АНБ, как в настоящее время применяются, завышенную частоту NSCs в смешанной популяции нейронных клеток-предшественников изолировать от эмбриональных и взрослых мозга млекопитающих. Это видео демонстрирует практически новый коллаген основан полутвердых анализ, нейронные-колониеобразующих анализа клеточной (N-ЦАФД), которая имеет способность различать стволовых из клеток-предшественников в зависимости от их долгосрочного пролиферативный потенциал, и таким образом обеспечивает метод перечислить НСК частоты. В N-ЦАФД, колоний ≥ 2 мм в диаметре получены из клеток, которые отвечают всем функциональным критериям НСК, в то время как колонии <2мм являются производными от прародителей. N-ЦАФД процедура может быть использована для клеток, полученных из различных источников, включая первичный и культурный взрослого или эмбриональные клетки мыши ЦНС. Здесь мы используем клетки получали из проезд один нейросферы генерируется из эмбриональных 14-й день мышей мозг для выполнения N-ЦАФД. Культуры пополнился распространения среду каждые семь дней в течение трех недель, чтобы покрытые клетками, чтобы продемонстрировать свой полный пролиферативный потенциал, а затем частота нейронных предшественников и добросовестных нервные стволовые клетки, рассчитывается соответственно, подсчитывая число колоний, которые являются <2 мм и те, которые ≥ 2 мм в ссылке на количество клеток, которые изначально были покрыты.
Protocol
1. Объекты, которые должны быть готовы Прежде чем приступить к сотовый Покрытие:
- Соответствующие объемы полной среде НСК получают путем смешивания NeuroCult НСК базальной среды и NeuroCult НСК распространения дополнений в 9:01 отношения, соответственно.
- Аликвоту NeuroCult NCFC бессывороточной среде без Цитокины не разморозится.
- Средний разогревается в 37 ° С водяной бане.
- Исходные растворы эпидермального фактора роста (ЭФР), основной фактор роста фибробластов (FGF-б) при концентрации 10 мкг / мл и гепарина на 0,2% готовы впереди.
- В зависимости от размера эксперимента, несколько 35-мм блюда культуры ткани необходимы для пластины клеток и один 150-200см пластиковые чашки Петри необходимо также провести дублировать 35 блюд и третий 35 мм блюдо для воды.
2. Сотовые приготовления:
В зависимости от вашего эксперимента, клетки могут быть получены из взрослого или эмбриональных источников (первичные диссоциированных тканей или диссоциированных нейросферы). Рассеките тканей взрослого / эмбриональных мыши центральной нервной системы (ЦНС), либо диссоциируют взрослый / эмбрионального происхождения нейросферы, как описано выше 1,2, а затем:
- Суспензии отдельных клеток проходит через 40-мкм размер ячейки фильтра так, чтобы устранить не-диссоциированных сгустки.
- 10 мкл клеточной суспензии смешивается с 90μl из Трипановый синий выполнять клеток. Примечание: Другие соответствующие разведения клетка может также использоваться.
- При использовании первичных эмбриональных или взрослых производным нервных клеток, разбавленные суспензии клеток в концентрации 6,5 · 10 5 клеток / мл в полной среде НСК. Если с использованием клеток из диссоциированных нейросферы производным от взрослого или эмбриональные нервные клетки, разбавленные суспензии клеток в концентрации 2,2 · 10 5 клеток / мл в полной среде НСК.
3. Покрытие Ячейки в полу-твердый N-ЦАФД среда:
- Соответствующий объем следующие компоненты смешиваются в порядке, в зависимости от количества дубликатов. Здесь мы смешиваем сумму, необходимую для двух повторяет или дублировать блюд. Дополнительные номера дубликатов, пожалуйста, обратитесь к таблице 1.
- 1,7 мл NeuroCult NCFC бессывороточной среде без Цитокины
- 330 мкл NeuroCult НСК добавки распространения
- 6,6 мкл EGF (10μg/mL)
- 32 мкл Пенициллин / стрептомицин
- 3,3 мкл б-FGF (10μg/mL) необходимо использовать только при культивировании клеток, полученных от взрослых нервных клеток.
- 3,3 мкл гепарина (0,2%) необходимо использовать только при культивировании клеток, полученных от взрослых нервных клеток.
- 25 мкл суспензии клеток (в 2,2 х 10 5 клеток / мл клетки диссоциированных нейросферы или 6,5 х 10 5 клеток / мл первичных клеток из диссоциированных тканей ЦНС). Примечание: окончательный номера сотовых покрытие должно быть около 2500 клеток на 35 мм блюдо культуры для neurosphere клеток, полученных до 7500 клеток на 35 мм блюдо культуры для первичных клеток. В некоторых случаях конечная плотность покрытия клетка должна быть скорректирована путем проведения эксперимента ячейки титрования. Для статистического анализа, общее количество колоний обнаружены после 21 дней культуры должны быть в пределах не менее 50 - 150 колоний.
- Среде, содержащей клетки смешиваются мягко, а затем 1,3 мл холодного раствора коллагена передается клеточной суспензии и хорошо перемешивают, осторожно пипеткой, чтобы избежать введения каких-либо пузыри.
- Смешанный раствор разливают в центре каждого 35мм блюдо культуры (~ 1,5 мл / блюдо) и блюда наконечником мягко использованием круговых движений, чтобы смесь равномерно распределить по поверхности тарелки. .
- Дублировать 35 блюд мм культуры помещают в 100 мм пластины Петри. Крышка новых 35 мм блюдо снимается и открытых блюдо будет также размещена в те же 100 мм блюдо Петри. Стерильная вода добавляется к этой открытой 35 мм блюдо для поддержания оптимальной влажности в течение инкубационного периода. Площадь пластин биопроб (245 мм) используются, когда более 35 мм повторить блюда были созданы. Опять же, включают в себя 2 или 3 открытых 35 мм блюд, содержащих стерильной водой.
- Пластины передается термостат при температуре 37 ° C, 5% СО2 и 95% влажности. Коллагена застывает за счет повышения температуры и образование геля происходит в течение примерно одного часа. Культур не должна быть нарушена в это время.
- Культивируемые клетки инкубируют в течение 21 дней (различия в колонии размер может быть четко отделены после 21 дней).
4. Подготовка Пополнение среднего и кормление Культура:
При N-ЦАФД культуры инкубируют в течение длительного периода времени (21 дней), культуры должны быть поданы с соответствующим полным NeuroCult Пополнение среду приготовить свежую следующим образом:
- 4,5 мл NeuroCult НСК базальной среды, смешивают с 0,5 мЛ NeuroCult НСК добавки распространения и факторов роста, добавляется:
- 250 мкл 10μg/mL EGF (для придания конечной концентрации 0,5 мкг / мл EGF)
- 125 мкл 10μg/mL б-FGF (для придания окончательной концентрации 0.25μg/mL б-FGF) необходимо использовать только при культивировании клеток, полученных от взрослых нервных клеток.
- 125 мкл 0,2% гепарин, необходимо использовать только при культивировании клеток, полученных от взрослых нервных клеток.
- 60 мкл соответствующего полного среднего Пополнение NeuroCult (для эмбриона или взрослой клетки) добавляется в центре каждого NCFC блюдо Пробирной раз в 7 дней, в течение всей NCFC инкубации культуры Пробирной (21 дней).
5. Подсчет очков N-CFC Пробирной Производные колоний и Вычисление частоты добросовестных NSCs и нейронные клетки-предшественники:
- Каждый 35 мм культуры блюдо делается на сетке блюдо забил с сеткой размером 2,0 мм х 2,0 мм, и тогда оба блюда помещаются на столик микроскопа.
- Использование малой мощности (2.5X - 5X) объектива, каждое блюдо отсканированы и колонии забили в зависимости от их размеров.
- Колонии разделить на две основные категории:
- Менее 2 мм в диаметре
- ≥ 2 мм в диаметре
6. Представитель Результаты:
Как и в neurosphere анализа, посеянных клеток в N-CFC анализа начинают размножаться и делать небольшие колонии клеток в течение 3 - 7 дней после покрытия (рис. 1). Через две недели, колонии разных размеров могут быть выделены. Хотя большинство колоний, как правило, перестают расти после 14 дней, некоторые колонии продолжают увеличиваться в размерах. Днем 21, колонии могут быть отнесены к одной из четырех категорий: 1) менее 0,5 мм, 2) 0,5 - 1 мм в диаметре, 3) 1 - 2 мм и 4) ≥ 2 мм в диаметре. Практически, колонии меньше 2 мм в диаметре, называются предшественников производные (рис. 2) и колоний ≥ 2 мм в диаметре, называются НСК производные (рис. 3). Число колоний ≥ 2 мм в диаметре в общем посеянных клеток, представляет собой частоту фактического добросовестных нервные стволовые клетки с долгосрочными самообновлению и несколькими потенциальными возможностями. Общая neurosphere формирования частоты в частности популяции клеток через 7-8 дня в параллельном эксперименте NSA, по оценкам, быть похожими на общую колониеобразующих частота же популяции клеток после 21 дней в N-ЦАФД эксперимента. N-ЦАФД однако, обеспечивает более либеральные состоянии, так как каждая ячейка может показать весь свой пролиферативный потенциал.
| Компонент | 2 воспроизводит | 3 воспроизводит | 4 воспроизводит |
| NeuroCult NCFC бессывороточной среде без Цитокины | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult НСК распространения добавки | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 мкг / мл) | 6,6 | 9,9 | 13,2 |
| bFGF (10 мкг / мл), только для взрослых клеток | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Раствор гепарина (0,2%), только для взрослых клеток | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Пенициллин / стрептомицин (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| Клетки по адресу: 2,2 х 10 5 культуре клеток / мл или 6,5 х 10 5 первичных клеток / мл | 25 | 37,5 | 50 |
| Коллаген решения | 1300 | 1950 | 2600 |
Таблица 1. Компоненты полного N-CFC анализа культуры.
Рисунок 1. Представителем колоний в N-ЦАФД культуры прохождения одна E14 NSCs мыши 7 дней после покрытия. Колонии могут отображаться различные морфологии и размера. Оригинальные увеличении; 4x
Рисунок 2. Представителю предшественников производные колоний разного размера в N-ЦАФД культуры прохождения одна E14 мыши NSCs 21 дней после покрытия. Как показала практика, колонии различной морфологией, но и все менее 2 мм. Оригинальные увеличении; 4x
Рисунок 3. Представителю добросовестных стволовых клеток производных колонии в N-ЦАФД культуры прохождения одна E14 NSCs мыши через 21 день после покрытия. Стволовые клетки производные колонии могут отображаться различные морфологии (см.видео), но все они ≥ 2 мм в диаметре. Оригинальные увеличении; 4x
Discussion
Хотя neurosphere анализа 3,1,2 является наиболее распространенным методом для изоляции и расширения нервных стволовых клеток из различных источников, таких как взрослых и эмбриональных тканях центральной нервной системы, он не может точно измерить частоту НБК в смешанной популяции нейронных клеток-предшественников (стволовых и прародителей), сколько не один к одному между числом нейросферы и количество добросовестных стволовых клеток 4. Для устранения этого ограничения, оригинальные АНБ была адаптирована таким образом, чтобы позволить нейронных стволовых и прародителей расти на полную мощность распространения в течение трех недель 5-7. В отличие от жидких АНБ, в N-ЦАФД колонии на самом деле клонально получены, как полутвердые коллагеновой матрицы предотвращает миграцию одной посеянных клеток и агрегации колоний. Для последовательные результаты с этого анализа мы рекомендуем:
- Обеспечить суспензии отдельных клеток в оригинальном клеточной суспензии. Пройди свой суспензии отдельных клеток через 40-мкм размер ячейки фильтра так, чтобы устранить не-диссоциированных сгустки.
- Держите раствора коллагена на льду или в холодильнике +4 ° C. Коллаген является последний пункт для добавления в смесь суспензии клеток, как застывает за счет повышения температуры.
- Не забывайте кормить культуры каждую неделю. Добавление пополнения среде, содержащей фактор роста (а) раз в 7 дней позволит клетки продолжают распространяться на длительный период культуры.
- Конечной плотности покрытия ячейки были оптимизированы для клеток, полученных из первичного или культивированный нервных клеток, так что общее число колоний обнаружены после 21 дней культивирования в NCFC-находится в пределах не менее 50 - 200 колоний. Этот диапазон позволяет обнаружить редкие НСК производные колонии> 2 мм в диаметре в образцах, обеспечивая при этом достаточное количество колоний для статистического анализа. В зависимости от начальной ячейки источника, значительно меньше (<50) и увеличение числа колоний (> 250) иногда получены. Слишком мало колоний приведет к колонии> 2 мм в диаметре были ниже уровней обнаружения, в то время слишком много колоний приведет к переполненности anddepletion роста компонентов среды приводит к неточным подсчетом колонии. Поэтому плотность клеток покрытия должны быть соответствующим образом скорректированы (т.е. увеличение или уменьшение общего количества посеянных клеток)
Disclosures
Один из авторов, Шарон А. Луи, является филиалом StemCell Technologies Inc, производитель некоторые реагенты, используемые в данном исследовании.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансирование из Оверстрит Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
