Summary
Este protocolo vídeo demonstra como discriminar e enumerar bona fide células-tronco neurais em uma população mista de células precursoras neurais utilizando o ensaio de célula neural formadoras de colônias.
Abstract
O ensaio neurosphere (NSA) é um dos métodos mais usados para isolar, expandir e também calcular a freqüência de células-tronco neurais (NSCs). Além disso, este sistema de cultura sem soro também tem sido usado para expandir células-tronco e determinar sua freqüência a partir de uma variedade de tumores e tecidos normais. Foi demonstrado recentemente que um relacionamento um-para-um não existe entre a formação neurosphere e NSCs. Isto sugere que a NSA como actualmente aplicado, superestima a freqüência de NSCs em uma população mista de células precursoras neurais isoladas tanto o cérebro embrionárias e adultas dos mamíferos. Este vídeo demonstra praticamente um romance baseado colágeno semi-sólido ensaio, a neural-formadoras de colônia ensaio de células (N-ACCP), que tem a capacidade de discriminar-tronco a partir de células progenitoras com base em seu potencial de longo prazo proliferativa, e, portanto, fornece um método para enumerar freqüência NSC. No N-CFCA, colônias ≥ 2 mm de diâmetro são derivadas de células que cumprem todos os critérios funcionais de NSC, enquanto colônias <2mm são derivadas de células progenitoras. O procedimento de N-CFCA pode ser usado para as células preparadas a partir de diferentes fontes, incluindo adultos primário e cultivadas ou células do SNC embrionárias de camundongos. Aqui usamos células preparadas a partir de uma passagem neurospheres gerados a partir de dia embrionário 14 cérebro de ratos para realizar N-CFCA. As culturas são reabastecidos com meio de proliferação a cada sete dias durante três semanas para permitir que as células banhado a exibir todo o seu potencial proliferativo e, em seguida, a freqüência de progenitoras neurais e de boa-fé células-tronco neurais são calculados, respectivamente, por contagem do número de colônias que são <2mm e os que estão ≥ 2mm em referência ao número de células que foram inicialmente banhado.
Protocol
1. Itens que precisam ser preparados antes de prosseguir para Galvanização Cell:
- Volume apropriado de meio NSC completo é preparado pela mistura NeuroCult NSC Basal Medium e Suplementos NeuroCult NSC Proliferação na proporção 9:1, respectivamente.
- Uma alíquota de NeuroCult NCFC meio isento de soro sem Citocinas é descongelado.
- O meio é aquecido em banho-maria a 37 ° C.
- Soluções estoque de fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento básico de fibroblastos (b-FGF), na concentração de 10 mcg / mL e heparina em 0,2% estão dispostos à frente.
- Dependendo do tamanho experimento, várias placas de cultura de 35 milímetros de tecido são necessários para a placa de células e um 150-200cm de plástico placa de Petri também é necessária para manter os pratos duplicar 35mm e um terceiro prato 35mm para água.
2. Preparação de células:
Dependendo do seu experimento, as células podem ser preparados a partir de uma fonte adulta ou embrionária (tecido dissociado primária ou neurospheres dissociada). Dissecar os tecidos do adulto / embrionárias mouse do sistema nervoso central (SNC) ou dissociar neurospheres adulto / embrionárias derivadas de 1,2 como descrito anteriormente e, em seguida:
- A suspensão única célula é passado através de um filtro de malha 40 mícrons de tamanho, de modo a remover não-dissociada aglomerados.
- 10μl da suspensão de células é misturado com 90μl de Trypan azul para realizar uma contagem de células. Nota: Outras diluições célula apropriada também pode ser usado.
- Se estiver usando embrionárias primárias ou adultas derivadas de células neurais, diluir a suspensão de células a uma concentração de 6,5 x 10 5 células / mL em meio NSC completa. Se estiver usando células de neurospheres dissociada derivado de adulto ou embrionárias células neurais, diluir a suspensão de células a uma concentração de 2,2 x 10 5 células / mL em meio NSC completa.
3. Células chapeamento em meio semi-sólido N-CFCA:
- O volume apropriado dos seguintes componentes é misturado em ordem, dependendo do número de repetições. Aqui nós misturamos o montante necessário para duas repetições ou duplicar pratos. Para os números de repetições adicionais, consulte a tabela 1.
- 1,7 mL de NeuroCult NCFC meio isento de soro sem Citocinas
- 330 mL de Suplementos NeuroCult NSC Proliferação
- 6,6 mL de EGF (10μg/mL)
- 32 mL de penicilina / estreptomicina
- 3,3 mL de b-FGF (10μg/mL) necessária apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural.
- 3,3 mL de heparina (0,2%) necessitaram de apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural.
- 25μL da suspensão de células (de 2,2 x 10 5 células / mL de células neurospheres dissociada ou 6,5 x 10 5 células / mL pilhas de tecido do SNC dissociado). Nota: Os números célula final deve ser banhado a cerca de 2500 células por milímetro 35 placa de cultura para neurosphere células derivadas e 7500 células por 35 mm para placa de cultura de células primárias. Em alguns casos, a densidade de células de revestimento final, tem que ser ajustada através da realização de um experimento de titulação celular. Para as análises estatísticas, o número total de colónias detectadas após 21 dias de cultura deve estar dentro do intervalo de pelo menos 50-150 colônias.
- O meio contendo as células é misturado com cuidado e, em seguida, 1,3 mL de solução de colágeno frio é transferido para a suspensão de células e misturar bem pipetagem suave para evitar a introdução de bolhas.
- A solução mista é dispensado para o centro de cada placa de cultura de 35 mm (~ 1,5 mL / prato) e os pratos estão inclinados suavemente com movimentos circulares para que a mistura espalhada uniformemente sobre a superfície do prato. .
- A segunda via placas de cultura de 35 mm são colocados em uma placa de 100 milímetros Petri. A tampa do prato milímetros novo 35 é removido eo prato aberto também é colocado no prato de 100 milímetros mesma Petri. Água estéril é adicionado a este prato mm abrem 35 para manter a umidade ideal durante o período de incubação. Placas de bioensaio quadrado (245 mm) são usadas quando mais replicar 35 milímetros pratos foram criados. Mais uma vez, incluir 2 ou 3 abertas 35 pratos mm contendo água estéril.
- As placas são transferidas para um conjunto de incubadora a 37 ° C, 5% CO2 e umidade de 95%. O colágeno congela por aumento da temperatura ea formação de gel irá ocorrer dentro de aproximadamente uma hora. As culturas não deve ser perturbado durante este tempo.
- Células em cultura são incubados por 21 dias (diferenças de tamanho da colônia pode ser claramente distinguido após 21 dias).
4. Preparando Médio Replenishment e Alimentação da Cultura:
Como N-CFCA culturas são incubados por um período de tempo prolongado (21 dias), as culturas devem ser alimentados com a NeuroCult apropriado completo médio de reposição preparado fresco da seguinte forma:
- 4,5 mL de NeuroCult NSC Basal Medium é misturado com 0,5 mL de Suplementos NeuroCult NSC Proliferação Nuclear e, em seguida, os fatores de crescimento é adicionado:
- 250 L de 10μg/mL EGF (para dar uma concentração final de 0,5 mg / mL EGF)
- 125 mL de 10μg/mL b-FGF (para dar uma concentração final de 0.25μg/mL b-FGF) necessária apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural.
- 125 mL de heparina de 0,2%, necessária apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural.
- 60 mL do Médio completo Replenishment NeuroCult apropriado (por células embrionárias ou adultas) é adicionado para o centro de cada prato Assay NCFC uma vez a cada sete dias durante a incubação cultura NCFC Assay inteiro (21 dias).
5. Colônias de pontuação N-CFC Assay Derivados e Cálculo da Freqüência de bona NSCs Fide e células progenitoras neurais:
- Cada placa de cultura 35 mm é colocado em um prato de pontuação em grade com o tamanho da grade de 2,0 mm x 2,0 mm e, em seguida, ambos os pratos são colocados no palco microscópio.
- Usando baixa potência (2.5X - 5X) objetiva de cada prato é digitalizado e as colônias são pontuadas com base em seus tamanhos.
- Colônias são classificadas em duas categorias principais:
- Menos de 2 mm de diâmetro
- ≥ 2 mm de diâmetro
6. Resultados representativos:
Como no ensaio neurosphere, as células semeadas em N-CFC ensaio começam a proliferar e fazer pequenas colônias de células dentro de 3-7 dias após o revestimento (Figura 1). Dentro de duas semanas, as colônias de tamanhos diferentes podem ser distinguidos. Embora a maioria das colônias tende a parar de crescer após 14 dias, algumas colônias continuam a aumentar de tamanho. Ao dia 21, as colônias podem ser classificados em uma das quatro categorias: 1) menos de 0,5 mm de diâmetro, 2) 0,5-1 mm de diâmetro, 3) 1-2 mm de diâmetro e 4) ≥ 2mm de diâmetro. Praticamente, colônias menores que 2 mm de diâmetro são referidos como progenitor derivados (Figura 2) e colônias ≥ 2mm de diâmetro são denominados NSC derivados (Figura 3). O número de colónias ≥ 2mm de diâmetro por células totais chapeado, representa a freqüência da real bona fide células-tronco neurais de longo prazo auto-renovação e potencial multi-capacidades. O total de neurosphere formando freqüência em uma determinada população celular após 7-8 dias em um experimento paralelo NSA foi estimado para ser semelhante ao do total da colónia formando freqüência da população de células mesmo após 21 dias em um experimento de N-CFCA. O N-CFCA no entanto, oferece uma condição mais permissiva, de modo cada célula pode mostrar todo seu potencial proliferativo.
| Componente | 2 repetições | 3 repetições | 4 repetições |
| NeuroCult NCFC meio isento de soro sem Citocinas | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult NSC Suplementos Proliferação | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 mcg / mL) | 6,6 | 9,9 | 13,2 |
| bFGF (10 mcg / mL), apenas para células adultas | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Solução de heparina (0,2%), apenas para células adultas | 3,3 | 4,95 | 6,6 |
| Penicilina estreptomicina / (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| Células em: 2,2 x 10 5 cultura de células / ml ou 6,5 x 10 5 células primárias / mL | 25 | 37,5 | 50 |
| Solução de colágeno | 1300 | 1950 | 2600 |
Tabela 1. Componentes da cultura ensaio completo N-CFC.
Figura 1. Colônias Representante na N-CFCA cultura de NSCs uma passagem E14 rato sete dias após o plaqueamento. As colônias podem exibir morfologia diferente e tamanho. Ampliação original; 4x
Figura 2. Colônias progenitor Representante derivados de diferentes tamanhos em N-CFCA cultura de uma passagem do mouse E14 NSCs 21 dias após o plaqueamento. Como mostrado, as colônias têm morfologia diferente, mas todos são mm menos 2 em tamanho. Ampliação original; 4x
Figura 3. Representante bona fide de células-tronco derivadas colônia em N-CFCA cultura de uma passagem do mouse E14 NSCs 21 dias após o plaqueamento. Colônias de células-tronco derivadas podem exibir morfologia diferentes (vero vídeo), mas todos são ≥ 2mm de diâmetro. Ampliação original; 4x
Discussion
Embora ensaio neurosphere 3,1,2 é o método mais comum para isolar e expandir as células-tronco neurais de uma variedade de fontes como adultas e embrionárias tecido do SNC, que não pode medir com precisão a freqüência NSC em uma população mista de células precursoras neurais (caule e progenitores) como não há uma relação de 12:59 entre o número de neurospheres eo número de bona fide células-tronco 4. Para resolver esta limitação, a NSA original foi adaptado de modo a permitir o tronco neurais e progenitores a crescer a sua capacidade de proliferação integral, durante três semanas 5-7. Ao contrário da NSA líquido, na N-CFCA as colônias são realmente clones derivados, como a matriz de colágeno semi-sólido impede a migração das células único banhado e agregação de colônias. Para obter resultados consistentes com este ensaio, recomendamos:
- Garantir uma suspensão única célula na suspensão celular original. Passe sua suspensão única célula através de um filtro de malha 40 mícrons de tamanho, de modo a remover não-dissociada aglomerados.
- Manter a solução de colágeno no gelo ou no frigorífico 4 C °. O colágeno é o último item a ser adicionado à mistura de suspensão de células, uma vez que congela, aumentando a temperatura.
- Não se esqueça de alimentar a cultura a cada semana. Adicionando o meio contendo reposição do fator de crescimento (s) uma vez a cada sete dias irá permitir que as células continuam a proliferar durante o período de cultura prolongada.
- A densidade de células de revestimento final, foram otimizados para células derivadas de células primárias ou neural ou cultivadas de modo que o número total de colónias detectadas após 21 dias de cultura na NCFC-A está dentro da faixa de pelo menos 5-20 colônias. Esta gama permite a detecção dos raros NSC colônias derivadas> 2mm de diâmetro em amostras ao fornecer um número suficiente de colônias para análises estatísticas. Dependendo da fonte de célula inicial, um número significativamente menor (<50) e um maior número de colônias (> 250) são por vezes obtidos. Colônias muito poucos resultará nas colônias> 2mm de diâmetro sendo abaixo dos níveis de detecção, enquanto colônias demais resultará em anddepletion superlotação dos componentes do crescimento a médio, resultando em uma contagem de colônias imprecisas. Portanto, a densidade de células de revestimento deverá ser ajustada em conformidade (isto é, aumentando ou diminuindo o número total de células plated)
Disclosures
Um dos autores, Sharon A. Louis, é afiliado com StemCell Technologies Inc, produtora de alguns reagentes utilizados neste estudo.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo financiamento da Fundação Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
