Summary
在这里，我们描述了一个成本效益的技术，七天为成年猪视网膜器官文化。简单地说，无菌滤纸用于解除神经视网膜视网膜色素上皮和地方感光一面向上插入一个定制的立场提出。
Abstract
是公认的体外模型的需求，可以取代或减少动物实验。猪视网膜有一个类似于人类视网膜的神经元结构，因此，为研究人类的视网膜损伤及退行性疾病的机制的珍贵物种。在这里，我们描述了从屠宰场取得的眼睛分离成年猪视网膜器官文化的成本效益的技术。取出后眼前段，环钻刀片是用来创建多个神经视网膜布鲁赫的成年猪眼后段膜的RPE -脉络膜巩膜植。一块无菌滤纸是用来解除每个外植体视网膜神经。滤纸视网膜复杂的培养（感光面朝上）之上插入一个定制的立场，这是从培养皿的底部。使培养基中的良好循环，视网膜双方的立场。总体而言，这个过程很简单，重现性好，并允许保存至少7天的本地视网膜结构，使其成为一个有用的模型的各种哺乳动物视网膜的形态，药理，生化研究。
Protocol
1。一个细胞培养插入定制的立场
5毫升枪头（ISC BioExpress，＃P - 3250 - 19）的基础内径13毫米，这完全匹配的底部尺寸（12.6毫米，外径）10毫米（内径）NUNC细胞文化插入（聚碳酸酯膜，热，8微米，＃137443）。要的立场，吸液管被切断基地附近产生一个长6毫米的空心圆柱。然后，件从气缸侧面，采用火焰加热的刀片下创建一个环（2毫米高度），这引起了插入的高度约5毫米的3腿（4毫米高度）。
2。猪视网膜的依恋和文化的无菌滤纸的制备
4M的Whatman滤纸（猫号1004）移动到一个玻璃管的杀菌或一旦视网膜重视滤纸具有体积小，三角形的处理（如被切断成圆弧状（直径6.3毫米）在视频显示）。
3。视网膜外植体的制备
从5眼 - 9个月的老，150-230英镑，美国约克夏猪屠宰场（在冰上运输），在三个小时眼球摘除内从一个地方。抵达后，眼睛是多余的组织清理，蘸优碘的解决方案（碘伏10％，在普渡大学弗德瑞克公司，斯坦福，CT）和贝科的修改鹰中等（DMEM培养液1克/大号葡萄糖，L -谷氨酰胺洗2次，补充2.5微克/毫升两性霉素B（GIBCO Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）和丙酮酸钠，Cellgro科技股份有限公司，Manasses，弗吉尼亚州）。眼前段被拆除，露出视网膜神经。六毫米的环钻刀片（Storz成为眼科博士伦，曼彻斯特，MO），用来切割赤道，后段全层植。随后视网膜剥落一块干燥无菌滤纸轻轻地应用到神经节细胞层，解除神经视网膜，并放置到文化插入附加视网膜滤纸，光感受器朝上。插入，然后放入培养液，确保全面覆盖的视网膜，在12孔培养皿（费舍尔）。多植获得常规，并从单一的眼睛培养。
4。组织培养
鹰的最低限度的基本中培养的视网膜组织，Invitrogen公司GIBCO -生命科技公司，马里兰州洛克维尔（MEM），pH值7.4，辅以谷氨酰胺为0.2毫克/毫升，10微克/毫升猪胰岛素，丙酮酸1毫米，0.1毫米L -抗坏血酸，100 U / ml青霉素，100μg/ mL链霉素，和250 ng / ml的两性霉素B（抗生素Antimycotic：Sigma公司，圣路易斯，密苏里州），加湿5％的CO 2，平衡空气曝气，在37 ° C交换液每两天。
组织可使用多种试剂或探针治疗，或向左，为后续的生化或形态学分析未处理。以下部分介绍了程序，以创建一致的全层视网膜截面。
5。切片
- 使用一个低温恒温器
- 一夜之间修复视网膜组织在4％parafomaldehyde 4℃;
- 简单地冲洗组织与磷酸盐缓冲液（PBS）;
- 小心取出滤纸的组织，而它在PBS是在解剖镜下使用的35毫米菜;
- 组织转移30％的蔗糖，并保持在4℃过夜℃;
- 周围组织吸走多余的溶液，添加足够的组织TEK培养基（华侨城复方4583），以支付组织，并让它浸泡2小时，在室温下渗透到组织;
- 建立一个与牙科用蜡的方形镜框（10毫米× 10毫米，5毫米的高度）和周围的组织，它添加更多的组织TEK介质填充帧（确保组织样本是平）和在冷冻（ - 20 ° C）的至少1个小时;
- 冷冻样品块传输到样品台上（确保样本块垂直平台）;
- 预冷却的低温恒温器安装在样品台上（-20 ° C，莱卡，CM1900），并确保该块刀片垂直;
- 删除前所需厚度的组织切片的蜡和帧块;
- 明胶处理过的幻灯片上放置的部分。
- 使用一个Vibratome
- 上面所述的低温恒温器的组织修复和冲洗;
- 组织放入预先加热，融化的琼脂在一个小容器4％，并保持在4 ° C，直到琼脂凝结完全;
- 使用锋利的刀片，修剪成小块状的组织样本里的琼脂;
- 胶vibratome与Krazy胶样品架（确保组织样本中的一块是垂直的TH平台的样品块发送样品架，即，垂直的刀片），并装上vibratome切片系统完全淹没在冰冷的海水样品块（莱卡，1000系列）的持有人;
- 切成50微米的部分样品块和明胶处理过的幻灯片，用软毛刷。
6。免疫组织化学
使用任何标准的协议。 Immunolabeled厚的部分可以被看作共聚焦显微镜。
7。代表性的成果：
保存在七天内的文化形态。前和后培养的视网膜图像，视频。
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Discussion
视觉研究人员已经建立了各种视网膜文化系统，包括器官系统，研究各种问题，如视网膜干细胞移植，视网膜再生 2，外源基因表达 3-5 。然而，成年哺乳动物视网膜是难以维持在体外 ，主要是由于高能源需求的光感受器6。小泉纯一郎等人描述了兔子的视网膜器官文化系统中，光感受器的氧气供应，提高文化插入的高度和搅拌培养基减轻。他们成功地维持长达6天4,5成人视网膜组织。 Kobuch 等人描述为成年猪的视网膜和视网膜色素上皮（RPE）灌注培养系统，并能维持至少10 天 7的器官组织。然而，准备实验室操纵的视网膜色素上皮 - 脉络膜表的过程很复杂，需要特殊的工具。此外，每个外植体需要繁琐的多个组织样本在体外培养使自己的灌注系统。肯普夫等人成功地创建了另一成年哺乳动物的感觉神经视网膜与RPE细胞共培养的器官型培养模式，但只表现为一个为期3天的的文化成果;组织的长期生存 ，没有测试8。
在这个手稿中，我们描述了一个简单的成年猪神经视网膜采取类似的做法，以前兔视网膜 4具有以下特点的器官型培养，重现性协议：
- 创建一个简单的技术，使一个自定义的立场，以提高文化插入的高度，对整个视网膜外植体，确保良好的氧气供应。使用5毫升枪头创建的立场，以确保可高压灭菌的立场，并可以调整高度，如果需要的话。
- 文化与视网膜的感光层朝上，而不是神经节细胞层。这样一来，光感受器增加获得氧气，并搅拌，以进一步增加氧气供应是没有必要的。
- 最大限度地减少机械创伤。在剥离的视网膜色素上皮前，视网膜植无菌滤纸，然后在滤纸上的培养，从而减少对组织的机械应力和防止视网膜卷曲。
- 在视网膜外植体的大小的一致性。由于环钻是用来创建的外植体，每个视网膜植体是相同的大小，从而很容易地比较各种治疗方法的结果。
- 保存的形态。在这种文化系统的猪视网膜的结构仍然完整的至少7天。
由于猪和人类的视网膜细胞的分布和形态，血管纹层的厚度，以及其他生理特征9,10非常相似，猪视网膜器官的文化提供一个有吸引力的动物模型，为研究人类的视网膜疾病的表现，变性，并受伤。该系统可在人的视网膜上的体外实验无法进行，一部分是由于缺乏高品质的人体组织的情况下尤为重要。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院授予安永012031（ET），FM柯比基金会（ET），研究奖，以防止失明，公司（MAZ），新泽西州狮子会眼研究基金会（MAZ）的支持，新泽西州（MAZ），约瑟夫J和玛格丽特DiSepio视网膜病变的研究基金（MAZ），贾尼斯米切尔瓦萨和Ashby米切尔奖学金（AMK）的眼科研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
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