Summary
Qui si descrive una soluzione economica per la cultura tecnica organotipica di retina suini adulti per sette giorni. In breve, una carta sterile filtro è stato usato per sollevare la retina neurale fuori dal RPE e fotorecettori lato posto su un inserto sollevata da una misura stand.
Abstract
Vi è una domanda riconosciuto per modelli in vitro che può sostituire o ridurre gli esperimenti sugli animali. Retina suina ha una struttura simile a neuronale retina umana ed è quindi una specie preziosa per lo studio dei meccanismi di lesione della retina umana e le malattie degenerative. Qui si descrive una soluzione economica per la cultura tecnica organotipica di retina suini adulti isolati da occhi ottenuti da un mattatoio. Dopo aver rimosso il segmento anteriore, una lama trapano è stato utilizzato per creare più neurali retina-membrana di Bruch-RPE-coroide, sclera espianti dal segmento posteriore degli occhi suini adulti. Un pezzo di carta da filtro sterile è stato utilizzato per sollevare la retina neurale fuori da ogni espianto. Il filtro di carta retina complesso è stato colto (lato fotorecettori verso l'alto) in cima a un inserto, che si è tenuto lontano dal fondo del piatto la cultura da una misura stand. Il supporto permette una buona circolazione del terreno di coltura su entrambi i lati della retina. Nel complesso, questa procedura è semplice, riproducibile, e permette la conservazione dei nativi struttura della retina per almeno sette giorni, che lo rende un modello utile per una varietà di studi morfologici, farmacologico, biochimico e sulla retina dei mammiferi.
Protocol
1. Fare una misura stand per inserti in colture cellulari
La base di una pipetta da 5 ml di punta (ISC BioExpress, # P-3250-19) ha un diametro interno di 13 mm, che corrisponde perfettamente alla dimensione inferiore (12,6 mm, diametro esterno) di mm 10 (diametro interno) di cellule NUNC inserto cultura (8 micron, membrana in policarbonato, termica, # 137443). Per rendere lo stand, la pipetta è stata tagliata vicino alla base per la produzione da 6 mm lungo cilindro cavo. Poi, i pezzi sono stati rimossi dal lato del cilindro usando una fiamma riscaldato lama di creare 3 gambe (4 mm di altezza) con un anello (2 mm di altezza), che ha sollevato l'altezza degli inserti di circa 5 mm.
2. Preparazione di carta da filtro sterile per il fissaggio e la cultura della retina suina
Carta da filtro Whatman 4M (Cat. No. 1004) è stato tagliato in una forma circolare (6,3 mm di diametro) con una piccola impugnatura triangolare che è stato utilizzato per spostare la carta da filtro in un tubo di vetro per la sterilizzazione o una volta che la retina è stata allegata (come mostrato nel video).
3. Preparazione di espianti di retina
Occhi da 5 - a 9 mesi di età, 150-230 lbs, americani maiali Yorkshire sono stati ottenuti da un mattatoio locale entro tre ore di enucleazione (trasportati in ghiaccio). All'arrivo, gli occhi sono stati puliti del tessuto estraneo, immerso in soluzione betadine (10% Povidone-iodio, la Società Purdue Frederique, Stamford, CT) e lavato due volte in Dulbecco modificato (DMEM con 1 g / L di glucosio, L-glutamina, e piruvato di sodio, Cellgro-Mediatech Inc., Manasse, VA) integrato con 2,5 mg / ml di amfotericina B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). Il segmento anteriore è stato rimosso, esponendo la retina neurale. Sei mm lame trapano (Storz oftalmica-Bausch & Lomb, Manchester, MO) sono stati utilizzati per tagliare equatoriale, a tutto spessore espianti segmento posteriore. La retina è stata successivamente staccate delicatamente applicando un pezzo di carta asciutta da filtro sterile sullo strato di cellule gangliari, alzando il piede della retina neurale, e mettendo la carta da filtro con retina attaccato sul inserto cultura, fotorecettori verso l'alto. L'inserto è stato poi inserito in terreno di coltura, avendo cura di coprire completamente la retina, in un piatto ben 12-cultura (Fisher). Espianti multiple sono state ottenute regolarmente e colto da un solo occhio.
4. Tessuto cultura
Il tessuto retinico è stato coltivato in Medio minimi essenziali di Eagle (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc., Rockville, MD), pH 7.4, integrato con 0,2 mg / ml glutammina, 10 mg / ml di insulina suina, 1 piruvato mM, 0,1 mM di acido L-ascorbico, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 250 ng / ml di amfotericina B (antibiotico Antimicotici: Sigma, St. Louis, MO), e aerato con umidificata al 5% di CO 2, aria equilibrio, a 37 ° C. Medio è stato scambiato ogni due giorni.
Tessuti possono essere utilizzati, trattati con una varietà di reagenti o sonde, o non trattata per le successive analisi biochimiche o morfologiche. La sezione seguente descrive le procedure per creare coerente a tutto spessore della retina sezioni.
5. Sezionamento
- Utilizzando un criostato
- Fissare tessuto retinico nel 4% parafomaldehyde notte a 4 ° C;
- Sciacquare brevemente tessuto con tampone fosfato (PBS);
- Rimuovere con attenzione il tessuto dalla carta da filtro mentre è in PBS in un piatto da 35 mm utilizzando un microscopio a dissezione;
- Trasferimento di tessuto al 30% di saccarosio e mantenere una notte a 4 ° C;
- Aspirazione via la soluzione in eccesso intorno al tessuto, aggiungere sufficiente Tissue-Tek medio (OCT Compound 4583) per coprire i tessuti, e lasciare in ammollo a temperatura ambiente per 2 ore di permeare il tessuto;
- Costruire una cornice quadrata (10 mm x 10 mm, 5 mm di altezza) con impronte dentarie e mettetelo in tutto il tessuto; aggiungere più Tissue-Tek medio per riempire il fotogramma (assicurarsi che il campione di tessuto è piatto) e mettere in un freezer (- 20 ° C) per almeno 1 ora;
- Trasferire il blocco congelato campione ad una piattaforma campione (assicurarsi che il blocco del campione è verticale alla piattaforma);
- Montare il campione in una piattaforma pre-raffreddata criostato (-20 ° C, Leica, CM1900) e assicurarsi che il blocco è verticale per la lama;
- Rimuovere la cera e il blocco di frame prima di sezionare il tessuto di spessore desiderato;
- Posizionare le sezioni in gelatina trattati con diapositive.
- Utilizzando un Vibratome
- Fix e lavare il tessuto come sopra descritto per il criostato;
- Posizionare il tessuto in pre-riscaldato, agar fuso 4% in un piccolo contenitore e conservare a 4 ° C fino a quando il rapprende agar completamente;
- Utilizzare una lama affilata per tagliare l'agar in un piccolo blocco con il campione di tessuto interno;
- Incollare il blocco campione su un portacampioni vibratome con Krazy colla (assicurarsi che il pezzo di campione di tessuto è verticale alla piattaforma di secoloe titolare del campione, cioè perpendicolare alla lama) e montare il supporto su un sistema vibratome sezionamento (Leica, serie 1000) con il blocco del campione completamente immersi in acqua ghiacciata;
- Tagliare il blocco campione in 50 sezioni micron e disporli sulla gelatina trattati con le diapositive con una spazzola morbida.
6. Immunoistochimica
Utilizza un qualsiasi protocollo standard. Immunolabeled sezioni spesse possono essere visualizzati con un microscopio confocale.
7. Rappresentante dei risultati:
Morfologia è stata preservata durante il periodo di sette giorni di cultura. Le immagini della retina prima e dopo la coltura sono disponibili nel video.
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Discussion
I ricercatori hanno stabilito una visione varietà di sistemi di coltura della retina, compresi i sistemi organotipica, per studiare una serie di questioni, come il trapianto di cellule staminali della retina 1, la rigenerazione della retina 2, e l'espressione genica esogeni 3-5. Tuttavia, retina dei mammiferi adulti è difficile da mantenere in vitro, principalmente a causa della alte energie richieste dei fotorecettori 6. Koizumi et al. Descritto un coniglio sistema retinico cultura organotipica in cui è stato migliorato l'apporto di ossigeno per i fotorecettori, aumentando l'altezza dell'inserto cultura e agitando il terreno di coltura. Hanno mantenuto con successo tessuto retinico adulti per un massimo di sei giorni a 4,5. Kobuch et al. Descritto un sistema di coltura per la perfusione retina suini adulti e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) e sono stati in grado di mantenere il tessuto organotipica per almeno 10 giorni 7. Tuttavia, la procedura per la preparazione della retina-RPE-coroide fogli per la manipolazione di laboratorio è stato complicato e richiede utensili speciali. Inoltre, ogni espianto richiesto un proprio sistema di perfusione facendo in coltura in vitro di campioni di tessuto più ingombrante. . Kaempf et al creato con successo un altro modello organotipica cultura della retina dei mammiferi adulti neurosensoriale in co-coltura con RPE, ma solo ha mostrato risultati per una 3 giorni di cultura, la sopravvivenza a lungo termine del tessuto non è stato testato 8.
In questo manoscritto, si descrive un protocollo semplice e riproducibile per la cultura organotipica di suino adulto retina neurale adottando un approccio simile a quello descritto in precedenza per la retina di coniglio 4 con le seguenti caratteristiche:
- Creazione di una semplice tecnica per fare uno stand personalizzati per aumentare l'altezza dell'inserto cultura, assicurando buona scorta di ossigeno per l'espianto retina intero. Con una pipetta da 5 ml punta a creare il supporto assicura che il supporto può essere autoclavato e che l'altezza può essere regolata, se desiderato.
- Cultura della retina con lo strato dei fotorecettori verso l'alto, in contrasto con lo strato di cellule gangliari. In questo modo, i fotorecettori avere un maggiore accesso ad ossigeno, e l'agitazione per potenziare ulteriormente l'apporto di ossigeno non è necessario.
- Minimizzazione del trauma meccanico. Il espianti retinici sono collegati a sterili carta da filtro prima di sbucciarle dal RPE e poi sono coltivate sulla carta da filtro, riducendo così lo stress meccanico sul tessuto e la prevenzione della retina curling.
- La coerenza della dimensione di espianti di retina. Poiché un trapano viene utilizzato per creare il espianti, ogni espianto retinica è delle stesse dimensioni, rendendo semplice per confrontare i risultati dei vari trattamenti.
- Conservazione della morfologia. Struttura della retina suina in questo sistema di coltura rimane intatto per almeno sette giorni.
Dato che la retina umana e suina sono molto simili in termini di distribuzione cellulare e morfologia, modello vascolare, spessore e altre caratteristiche fisiologiche 9,10, la cultura organotipica della retina suina fornisce un interessante modello animale per lo studio delle manifestazioni di malattie della retina umana, degenerazioni, e lesioni. Questo sistema può essere particolarmente importante nei casi in cui esperimenti in vitro sulla retina umana sono impossibili da eseguire dovuto, in parte, alla mancanza di qualità dei tessuti umani.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere EY 012.031 (ET-A), un premio dalla Fondazione FM Kirby (ET-A), ricerca per la Prevenzione della Cecità, Inc. (MAZ), il New Jersey Lions Eye Research Foundation (MAZ), L'Istituto Eye of New Jersey (MAZ), il J. Giuseppe e Margherita DiSepio Retina Research Fund (MAZ), ed il Janice Mitchell Vassar e Ashby Mitchell Fellowship (AMK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y. 3rd, Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
