Summary
Burada yedi gün yetişkin porcine retinanın Organotipik kültürü için bir maliyet-etkin bir yöntem açıklanmaktadır. Kısaca, steril bir filtre kağıdı nöral retina ısmarlama stand tarafından gündeme getirilen bir ekleme RPE ve yer fotoreseptör yüzü yukarı kaldırmak için kullanılır oldu.
Abstract
Hayvan deneylerinde değiştirmek veya azaltabilir in vitro modeller için tanınan bir talep vardır. Domuz retina nöronal insan retina benzer bir yapısı vardır ve bu nedenle insan retina hasarı ve dejeneratif hastalık mekanizmaları çalışmak için değerli bir türdür. Burada bir mezbahaya elde gözleri izole yetişkin porcine retinanın Organotipik kültürü için bir maliyet-etkin bir tekniktir. Ön segment çıkardıktan sonra, trefin bıçak yetişkin porcine gözlerin arka segment birden fazla nöral retina Bruch membran RPE-koroid-sklerasına eksplantlar oluşturmak için kullanılmıştır. Nöral retina her eksplant kaldırmak için bir parça steril filtre kağıdı kullanıldı. Filtre kağıdı-retina kompleks, ısmarlama stand kültür çanak alt uzak yapıldı bir ekleme tepesine (en fotoreseptör yan) kültüre edildi. Stand retinanın her iki taraf için kültür ortamı iyi sirkülasyonu sağlar. Genel olarak, bu işlem tekrarlanabilir, basit ve en az yedi gün için doğal retina yapısının korunmasına izin verir, bir memeli retina üzerine çeşitli morfolojik, farmakolojik ve biyokimyasal çalışmalar için faydalı model.
Protocol
1. Hücre kültürü ekler için özel yapılmış bir stand yapma
5 ml pipet (ISC BioExpress, P-3250-19) tabanı, 13 mm, 10 mm alt boyutu (12.6 mm, dış çapı) (iç çapı) Nunc hücre mükemmel eşleşen bir iç çapı kültür eki (8 mikron, Polikarbonat membran, Termal, # 137.443). Pipet standı yapmak için, 6 mm uzunluğunda içi boş silindir üretmek için baz istasyonunun yakınında kesildi. Sonra parçaları, yaklaşık 5 mm yükseklik ekler kaldırdı bir halka (yüksekliği 2 mm) altında 3 bacaklarda (4 mm yükseklik) oluşturmak için bir alev ısıtılmış bıçak kullanarak silindirin yan çıkarıldı.
2. Domuz retinanın eki ve kültürü için steril filtre kağıdı hazırlanması
Whatman 4M Filtre kağıdı (Cat No: 1004) (as sterilizasyonu için ya da bir kez retinaya bağlı olduğu bir cam tüp içine filtre kağıdı taşımak için kullanılan küçük bir üçgen kulplu (çapı 6.3 mm) dairesel bir şekil kesildi video gösterilir).
3. Retina eksplantlar hazırlanması
Gözler 5 - 9 aylık 150-230 kg, eski, Amerikan Yorkshire domuz enükleasyon üç saat içinde yerel bir mezbahaya (buz üzerinde taşınan) elde edilmiştir. Varışta, gözleri dışarıdaki doku temizlenir vardı,, betadin çözüm (10% Povidon-İyot, Purdue Frederique Şirket, Stamford, CT) batırılmış ve Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (1g / L glukoz DMEM, L-glutamin iki kere yıkanır ve sodyum piruvat, Cellgro-Mediatech A.Ş., Manasses, VA) 2.5 mg / ml Amfoterisin B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) ile desteklenmiştir. Ön segment nöral retina açığa çıkarıldı. Altı mm trefin bıçakları (Storz Oftalmik Bausch and Lomb, Manchester, MO), ekvator, tam kalınlıkta arka segment eksplantlar kesmek için kullanılır. Retinanın daha sonra yavaşça ganglion hücre tabakası üzerine bir parça kuru steril filtre kağıdı uygulayarak nöral retina kaldırma ve kültür eklemek üzerine bağlı retina ile filtre kağıdı yerleştirerek, fotoreseptör yukarı bakacak şekilde sıyrılır. Eklemek sonra 12-iyi bir kültür çanak (Fisher), retina tamamen kapsayacak şekilde emin olmak için, kültür ortamı içine yerleştirildi. Birden çok eksplantlarında rutin olarak elde edilen ve tek bir göz kültüre edildi.
4. Doku kültürü
Retina dokusunun (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc, Rockville, MD), pH 7.4, 0.2 mg / ml glutamin, 10 mg / ml porcine insülin, 1 mM piruvat, 0.1 ile desteklenen Eagle Minimum Essential Orta kültür mM L-askorbik asit, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml streptomisin ve 250 ng / ml amfoterisin B (antimikotik Antibiyotik: Sigma, St Louis, MO) ve nemlendirilmiş% 5 CO 2, denge hava gazlı 37 ° C Orta iki günde bir değiştirildi.
Doku, kullanılan reaktifler veya probları çeşitli tedavi veya sonraki biyokimyasal ve morfolojik analizler için tedavi edilmezse olabilir. Aşağıdaki bölümde, tutarlı tam kalınlıkta retina kesitler oluşturmak için prosedürler açıklanmaktadır.
5. Kesit
- Kriyostat Kullanımı
- 4 gece 4% parafomaldehyde Fix retina dokusunun ° C;
- Fosfat tamponlu salin (PBS) ile kısaca doku durulayın;
- Bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak 35 mm çanak PBS ise filtre kağıdı dikkatlice doku kaldırmak;
- % 30 sukroz doku transferi ve 4 gece boyunca devam ° C;
- Uzakta Emiş doku çevresinde aşırı bir çözüm, doku karşılamak için yeterli Doku-Tek orta (OCT Bileşik 4583) ekleyin ve dokuya nüfuz için 2 saat boyunca oda sıcaklığında bekletme izin;
- Diş balmumu ile kare kare (10 mm x 10 mm, 5 mm yükseklik) oluşturun ve doku çevresinde yer, bir derin dondurucuda bir kare (doku örneği düz olduğundan emin olun) ve yerini doldurmak için daha fazla Doku-Tek orta eklemek (- 20 ° C) en az 1 saat;
- Örnek bir platform (örnek blok platform dik olduğundan emin olun) dondurulmuş örnek blok Transferi;
- Daha önceden soğutulmuş bir Kriyostat Mount örnek platformu (-20 ° C, Leica, CM1900) ve blok bıçak dik olduğundan emin olun;
- Istenilen kalınlıkta doku kesit önce mum ve çerçeve bloğu çıkarın;
- Jelatin tedavi slaytlar bölümlerde yerleştirin.
- Vibratome Kullanımı
- Düzeltme ve doku Kriyostat için yukarıda açıklandığı gibi durulama;
- Doku küçük bir kapta önceden ısıtılmış% 4, erimiş agar içine yerleştirin ve 4 ° C agar congeals kadar tamamen tutmak;
- Küçük bir blok içindeki doku örneği agar kesmek için keskin bir bıçak kullanın;
- Tutkal örnek blok vibratome Krazy yapıştırıcı ile bir numune tutucu (parça doku örneği th platform dik olduğundan emin olune numune tutucu, yani, dik bıçak) ve buzlu su tamamen sular altında örnek blok ile vibratome bir kesit sistemi (Leica Serisi 1000) tutucu monte;
- 50 mikron bölüme örnek blok kesin ve yumuşak bir fırça ile jelatin-tedavi slaytlar üzerine koyun.
6. İmmünohistokimya
Herhangi bir standart protokol kullanın. Immunolabeled kalınlığında kesitler konfokal mikroskop ile görülebilir.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
Morfoloji kültür yedi günlük süre boyunca korundu. Kültür öncesi ve sonrası retinanın Görüntüler video mevcuttur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vizyon araştırmacılar, retina kök hücre nakli 1, retina rejenerasyon 2, ve dışsal gen ekspresyonu 3-5 gibi çeşitli sorunları, çalışma Organotipik sistemleri de dahil olmak üzere, çeşitli retina kültür sistemleri kurduk . Ancak, yetişkin memeli retina, in vitro fotoreseptörlerin 6 yüksek enerji talepleri nedeniyle muhafaza edilmesi güçtür. Koizumi ve ark. Fotoreseptörlerin için oksijen kaynağı, kültür eklemek yüksekliği yükselterek ve kültür ortamı ajitasyon ıslah edildiği bir tavşan retina Organotipik kültür sistemi nitelendirdi . Onlar altı günde 4,5 kadar başarıyla korudu yetişkin retina dokusunun. Kobuch ve ark. Yetişkin porcine retina ve retina pigment epitel (RPE) bir perfüzyon kültür sistemi tanımlanmış ve en az 10 gün 7 için Organotipik doku koruyabilmiştir. Ancak, laboratuvar manipülasyon için retina-RPE-Koroid sayfa hazırlamak için prosedür karmaşık ve özel bir alet gerekmez. Ayrıca, her eksplant hantal birden fazla doku örnekleri in vitro kültürü kendi perfüzyon sistemi gereklidir. Kaempf ve ark. Ko-kültür yetişkin memeli nörosensoriyel retinanın RPE ile başka bir Organotipik kültür modeli başarıyla oluşturulmuş olan, ancak sadece 3 günlük bir kültür sonuçlar ortaya koydu; doku uzun süreli sağkalım 8 test edilmemiştir.
Bu yazıda, aşağıdaki özelliklere sahip tavşan retina 4 önceden açıklanan benzer bir yaklaşım benimseyerek yetişkin domuz nöral retina Organotipik kültürü için basit ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar:
- Tüm retinanın eksplant için iyi oksijen kaynağı sağlamak, kültür eklemek yüksekliğini artırmak için özel bir stand yapmak için basit bir tekniğin oluşturulması. Standı oluşturmak için 5 ml pipet standı otoklava olabilir ve istenilen yüksekliği ayarlanabilir olduğunu garanti eder.
- Kültür fotoreseptör tabakada retina ganglion hücre tabakası karşıt olarak, yukarı bakacak şekilde. Bu şekilde, fotoreseptörlerin oksijen erişimi arttı ve ajitasyon daha fazla oksijen kaynağı artırmak için gerekli değildir.
- Mekanik travma en aza indirilmesi. Retina eksplantlar RPE onları soyma önce steril filtre kağıdı bağlı olan ve daha sonra filtre kağıdı üzerinde kültür, böylece doku mekanik stresi azaltarak ve retina kıvırma önlenmesi.
- Retina eksplant büyüklüğü Tutarlılık. Bir trefin eksplantlar oluşturmak için kullanılan olduğundan, her bir retina eksplant böylece çeşitli tedavilerin sonuçlarını karşılaştırmak kolay, aynı boyutta.
- Morfolojisinin korunması. Bu kültür sistemi domuz retina yapısı, en az yedi gün süreyle bozulmadan kalır.
Domuz ve insan retina hücre dağılımı ve morfolojisi, vasküler desen, katman kalınlığı ve 9,10 diğer fizyolojik özellikleri bakımından çok benzer olduğu göz önüne alındığında, domuz retinanın Organotipik kültür, insan retina hastalıklarının belirtileri eğitim için cazip bir hayvan modeli dejenerasyonlar ve yaralanmalar. Bu sistem, insan retina üzerine in vitro deneyler nedeniyle, kısmen, yüksek kaliteli bir insan doku eksikliği gerçekleştirmek için imkansız olduğu durumlarda özellikle önemli olabilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe 012.031 EY (ET-A), Körlük, Inc (MAZ), New Jersey Lions Göz Araştırma Vakfı (MAZ) Önlemek için bir ödül FM Kirby Vakfı (ET-A), Araştırma, tarafından desteklenen New Jersey (MAZ), Joseph J. ve Marguerite DiSepio Retina Araştırma Fonu (MAZ) ve Janice Mitchell Vassar ve Ashby Mitchell Bursu (AMK) Göz Enstitüsü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y. 3rd, Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
