Summary
ここでは、七日のための大人のブタの網膜の器官培養のための費用対効果の高い手法を説明します。簡単に言えば、滅菌濾紙は、カスタムメイドのスタンドで発生したインサートにRPEと場所光受容体の側から神経網膜をリフトオフ使用されていました。
Abstract
動物実験を取り替えるか、または減らすことができるin vitroモデルのための認識が求められています。ブタの網膜は、人間の網膜に似た神経細胞の構造を有し、したがって、人間の網膜損傷や変性疾患のメカニズムを研究するための貴重な種です。ここでは、食肉処理場から得られる目から分離された大人のブタの網膜の器官培養のための費用対効果の高い手法を説明します。前眼部を除去した後、トレパンのブレードは、大人のブタの眼の後部から複数の神経網膜-ブルッフの膜RPE -脈絡-強膜の外植片を作成するために使用されました。滅菌ろ紙片は、それぞれの外植片から神経網膜をリフトオフ使用されていました。ろ紙 - 網膜の複合体は、カスタムメイドのスタンドで培養皿の底部から離れて開催された挿入、上に（最大光受容体の側）培養した。スタンドは、網膜の両側に培地の良い循環が可能になります。全体として、この手順では再現性、シンプルであり、そして少なくとも7日間にネイティブ網膜構造の保存を許可し、それ哺乳類網膜上に、形態学的薬理学的、および生化学的研究の様々な有用なモデルとなっています。
Protocol
1。細胞培養インサートのためのカスタムメイドのスタンドを作る
5ミリリットルピペットチップ（ISC BioExpress、＃P - 3250 - 19）のベースは完全に10 mmの底部のサイズ（12.6ミリメートル、外径）（内径）NUNCセルに一致する13ミリメートル、内径を持っていますカルチャーインサート（8μmの、ポリカーボネート膜、熱、＃137443）。スタンドを作るために、ピペットを6 mm長中空シリンダーを生産する基地の近くで切断されました。その後、作品は約5 mmでインサートの高さを上げリング（高さ2mm）、で3足（高さ4 mm）を作成するために火炎加熱ブレードを使用してシリンダーの側面から削除されました。
2。ブタ網膜の添付ファイルと文化のための滅菌濾紙の調製
ワットマン4Mフィルターペーパー（カタログ番号1004）（のような殺菌のためにまたは一度に網膜が添付されたガラス管にろ紙を移動するために使用されていた小さな、三角形のハンドルと円形（直径6.3 mm）に切断し、 ）ビデオに示す。
3。網膜外植片の調製
5〜アイズ - 9ヶ月歳まで、150〜230ポンド、アメリカのヨークシャー豚は核出の3時間以内に現地屠殺場（氷の上で輸送）から得た。到着時に、目は、余分な組織を洗浄した（10％ポビドンヨード、パデューフレデリック社、スタンフォード、コネチカット州）betadine溶液に浸漬し、ダルベッコ改変イーグル培地（1グラム/ Lグルコース含有DMEM、L -グルタミン、で2回洗浄しとピルビン酸ナトリウム、Cellgro - mediatech社、マナッセス、VAは）2.5μg/ mlのアムホテリシンB（ギブコ- Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）を補充した。前のセグメントは、神経網膜を露出、削除されました。六ミリトレフィンブレード（ストルツ眼科 - ボシュロム、マンチェスター、MO）は赤道、全層後部セグメントの外植片を切断するために使用された。網膜は、その後、光受容体を上にして、神経網膜上に持ち上げ、そして文化のインサートに接続されている網膜にろ紙を置き、ゆっくりと神経節細胞層の上に、乾燥滅菌ろ紙片を適用することにより、剥離した。インサートは、12穴培養皿（フィッシャー）で、完全に網膜をカバーすることを確認しながら、培養液中に置かれた。複数の外植片は、日常的に得られ、単一の目から培養した。
4。組織の文化
網膜組織は、0.2 mg / mlのグルタミン、10μg/ mlのブタのインシュリン、1mMのピルビン酸、0.1を添加したイーグル最小必須培地（MEM、Invitrogen社、ギブコ-ライフテクノロジーズ社、ロックビル、MD）、pH7.4の、で培養したmMのL -アスコルビン酸、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および250 ng / mlのアンホテリシンB（抗真菌抗生物質：シグマ、セントルイス、MO）、および加湿5％CO 2、バランスの空気を通気、 37℃培地は2日毎に交換した。
組織は、使用する試薬またはプローブのさまざまな治療、またはその後の生化学的または形態学的解析のために未処理のままにすることができます。以下のセクションでは、一貫性のある全層網膜の断面を作成する手順を説明します。
5。セクショニング
- クライオスタットを使用する
- 4℃で一晩4％parafomaldehydeの網膜組織を修復° C;
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で簡単に組織をすすいでください。
- それは解剖顕微鏡を使って35mmのディッシュにPBSにあるときに慎重にろ紙から組織を取り除く。
- 30％ショ糖に組織を転送し、4℃で一晩おく° C;
- 離れて吸引組織の周り余分な溶液を、組織をカバーし、それが組織に浸透するために、室温で2時間浸漬させるのに十分な組織- Tek社の培地（OCTコンパウンド4583）を追加します。
- 歯科用ワックスと正方形の枠（10ミリメートル× 10ミリメートル、5mmの高さ）を構築し、組織の周囲に配置します。冷凍庫のフレーム（組織サンプルが平らであることを確認してください）と場所を埋めるために、より組織- Tek社の培地を追加する（ - 20 ° C）少なくとも1時間。
- サンプルのプラットフォームに凍結サンプルのブロックを転送する（サンプルブロックがプラットフォームに垂直であることを確認してください）。
- あらかじめ冷却クライオスタット内のサンプルプラットフォームをマウントし（-20℃、ライカ、CM1900）とブロックがブレードに垂直であることを確認してください。
- 所望の厚さの組織を切片前にワックスとフレームのブロックを削除します。
- ゼラチン処理スライド上のセクションを置きます。
- ビブラトームの使い方
- クライオスタットのために上記のような組織を固定し、すすぎ;
- 小さな容器で予備加熱、溶融4％寒天にティッシュを置き、完全に寒天は固まるまで4℃で保つ;
- 内部の組織サンプルの小さなブロックに寒天をトリミングする鋭い刃を使用します。
- クレイジー接着剤でビブラトームサンプルホルダー（組織サンプルの部分が目のプラットフォームに対して垂直であることを確認する上で接着剤サンプルブロックeのサンプルホルダー、すなわち、垂直翼に）と完全に冷たい水に浸し、サンプルブロックとビブラトーム切片システム（ライカ、シリーズ1000）のホルダーをマウントします。
- 50μm以下のセクションにサンプルブロックをカットし、柔らかいブラシでゼラチン処理したスライド上に置きます。
6。免疫組織化学
任意の標準プロトコルを使用してください。免疫標識厚い切片は共焦点顕微鏡で見ることができます。
7。代表的な結果：
形態は文化の7日間の期間中保持された。培養前後の網膜の画像は、ビデオでご利用いただけます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ビジョンの研究者は、網膜幹細胞移植1、網膜再生2、および外来遺伝子発現3月5日などの問題、様々な勉強する器官系、を含む、網膜培養システムのさまざまなを確立している。しかし、成体哺乳類の網膜は、in vitroで光受容体6の高エネルギーの需要が主な要因を維持することは困難です。小泉らは、光受容体のための酸素供給が培養インサートの高さを上げると培養液を攪拌によって改善されたウサギ網膜器官培養系を説明。彼らは正常4,5最大6日間、成人の網膜組織を維持した。 Kobuch らは、成体ブタの網膜と網膜色素上皮（RPE）の灌流培養系を記載し、少なくとも10日間7器官組織を維持することができた。しかし、実験操作のために網膜- RPE -脈絡膜のシートを調製するための手順は複雑であり、特別なツールが必要でした。さらに、それぞれの外植片は、面倒な複数の組織サンプルのin vitro培養で作る独自の灌流システムを必要としていました。 。Kaempfらは、正常に RPEとの共培養における成体哺乳類の神経感覚網膜の他の器官培養モデルを作成しましたが、わずか3日間の培養のために結果を示したが、組織の長期生存は8をテストされていません。
この原稿では、我々は以前に以下の機能を持つウサギの網膜4に記載のものと同様のアプローチを採用する大人ブタ神経網膜の器官培養のためのシンプルで再現性のプロトコルについて説明します。
- 全体の網膜の外植片のために適切な酸素供給を確保するため、文化のインサートの高さを上げるために、カスタムスタンドを作るために単純な手法の創造。スタンドを作成するには、5 mlのピペットチップを使用すると、スタンドはオートクレーブすることができることと、必要に応じて高さを調整させることが可能です。
- 神経節細胞層とは対照的に、上を向いて、感光体層と網膜の文化。この方法では、光受容体は酸素へのアクセスが増加し、さらに酸素供給を高めるために攪拌する必要はありません。
- 機械的な外傷の最小化。網膜外植片は、RPEからそれらを剥離する前に滅菌濾紙に接続されており、それによって組織の機械的ストレスを軽減し、網膜のカールを防止する、濾紙上で培養されています。
- 網膜片の大きさの一貫性。トレフィンが外植片を作成するために使用されているので、それぞれの網膜外植片は、それによってそれが容易に様々な治療の結果を比較すること、同じ大きさです。
- 形態の保全。この培養系におけるブタ網膜の構造は、少なくとも7日間そのまま残ります。
ブタと人間の網膜の細胞の分布と形態、血管パターン、層の厚さ、および他の生理的特性9,10の面で非常に類似していることを考えると、ブタ網膜の器官培養では、人間の網膜疾患の症状を研究するための魅力的な動物モデルを提供変性、および負傷。このシステムは、人間の網膜上でin vitroの実験に起因する、一部では、高品質のヒト組織の不足に実行することが不可能な場合には特に重要である可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金EY 012031（ET -）、FM星のカービィ財団（ET -）、失明、株式会社（MAZ）、ニュージャージー州ライオンズアイ研究財団（MAZ）を、防止するための研究から、賞によって支えられてニュージャージー州（MAZ）、ジョセフJ.とマルグリットDiSepio網膜研究基金（MAZ）、そしてジャニスミッチェルヴァッサーとアシュビーミッチェルフェローシップ（AMK）の眼科研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y. 3rd, Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
