Bio Flip-Chip kullanarak Embriyonik Kök Hücreler, Desenlendirme

Summary

Biz, bir substrat üzerindeki istenilen noktada hücre yerleştirmek için basit bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntem desen hücreleri yüzeye hücreleri ile dolu mikro oyukların içeren bir silikon çip saygısız. Bu yöntem yayılabilir ve juxtacrine hücreleri arasındaki sinyal modüle etmek için yeni bir yol sağlar.

Abstract

Difüze sinyalizasyonu ve hücre-hücre teması (juxtacrine sinyalizasyon) oluşan hücre-hücre etkileşimleri, tümör büyümesini, kök hücre farklılaşması ve kök hücre kendini yenileme gibi çok sayıda biyolojik süreçlerde önemli. Yöntemler bir dizi in vitro hücre sinyal modüle var. Difüze sinyal modüle toplam miktarın bir yöntem kültür sırasında hücre ekim yoğunluğu değişebilir. Hücre tohumlama, bu gerçek, hücre-hücre aralığı ve hücre-hücre teması miktarı önemli farklılıklar sonuçları ve yerel çevre reçete rasgele doğası nedeniyle. Modüle hücre sinyal iletimi için daha özel bir yaklaşım özel sinyalleme proteinleri yıkmak için moleküler inhibitörleri ya da genetik yaklaşımlar kullanmak, ancak bu yöntemlerin her ikisinin en iyi moleküllerin az sayıda işlemek için uygundur. Burada, bir substrat üzerindeki istenilen noktada farklı hücre koyarak hücrelerden oluşan bir küme yerel çevre modüle modüle hücre-hücre sinyalleşme için yeni bir yaklaşım göstermektedir. Bu yöntem, hücreler arasındaki yerel yayılabilir ve juxtacrine sinyalizasyon kontrol etmek için birbirini tamamlayıcı bir şekilde sağlar. Bizim metodumuz Bio Flip-Chip (BFC) kullanımı, tek bir hücrenin veya hücre az sayıda tutmak için mikro oyukların, her büyüklükte yüzlerce-binlerce içeren bir microfabricated silikon çip yapar. Biz sadece dizi kuyu üzerine pipetleme ve dizi kapalı boş hücreleri yıkama hücreleri ile yonga yükleyin. Hücreleri desenlendirme bakımı, kuyuların ve yüzey üzerine dökülür sayede çip, sonra bir yüzey üzerine çevrilmiş. Hücreleri bağlı sonra, çip (veya sol) silinebilir. Bu yaklaşım, hücre desenlendirme benzersiz olduğunu: 1) böylece hücreleri çoğalırlar ve geçiş için izin, yüzey kimyası değiştirmez;, doku kültürü polistren, cam, matrigel de dahil olmak üzere, herhangi bir yüzey üzerine desenlendirme sağlar 2) ve Hatta besleyici hücre tabakaları ve 3) Bu adaların içine yerleştirilen hücreler ile ekstraselüler matriks adalar oluşturmaya olanak sağlayarak, geleneksel microcontact baskı ile uyumludur. Bu video, BFC kullanarak, doku kültürü polistiren üzerine fare embriyonik kök hücreleri desenlendirme göstermektedir.

Protocol

BFC yapma

BFCs 4 "Si ana gofret üzerinde kalıp polidimetilsiloksan (PDMS) tarafından yapılır.

Bir ana gofret yapma

1. 130 30 dakika Si gofret dehydrating başlayın ° C
2. Bir spin-lak gofret koyun, sırasıyla, 40-30 mm özelliği yükseklikleri verim s için 30 300 dev / s 3000-4000 rpm rampası, gofret üzerine SU8-2050 (Microchem) dökün ve spin.
3. Iplik sonra, 65 ° C ocak gofret, hemen 95 ° C 'de 5-6 dakika süreyle ve daha sonra 65 ° C'ye kadar aşağı rampa sıcaklık rampa
4. Karanlık alan bir maske kullanarak bir kişi hizalama UV dozu 200 mJ / cm ² gofret Açığa.
5. 65 ° C ocak gofret yerleştirin hemen sıcaklığı 95 rampa ° C, sonra 4-5 dakika süreyle ve 65 ° C'ye kadar aşağı rampa
6. PM asetat ve Isopropanol gofret geliştirin.
7. Hexamethyldisiloxane (Shin-Etsu MicroSi) kullanarak 30 dakika gofret Silanize veya (Tridecafluoro-1 ,1,2,2 tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane PDMS önlemek için (t2492-KG, UCT Özellikleri, Bristol, PA) Si ana gofret yapışmış.

Kalıp cips

1. 10:1 oranını Mix PDMS (Dow Corning, Sylgard 184), ana Si wafer (gofret ortalama ~ 15 g) üzerine dökün ve oda sıcaklığında bir gece tedavi sağlar.
2. Peel Si gofret kapalı PDMS tedavi ve jilet kullanarak her bir fiş kesmek.
3. Kolay kullanım için 1x1 cm 'lik kesim mikroskop lamı Bond her çip.

BFC kullanım için hazırlanması

1. PDMS deney sırasında medya emilimini önlemek için PBS içinde BFC bir gece bekletin.
2. Kimwipe (Kimtech Bilim) ile cips kurulayın.
3. % 7.5 bir damla koyun Sığır Serum Albumin (BSA) (~ 200 ml) BSA dağıtmak ve kuyulardan varsa kabarcıkları giderin bir pipet ile kazımak sonra BFC desenli yüzey,.
4. BSA BFC yüzey üzerinde en az 0,5 saat süreyle bırakın. İdeal BSA kabuklanma önlemek için her 15 dakikada bir ajitasyon.
5. 35x10 mm TCP'lerin çanak içinde BFC (Falcon, 35-3001) sığdırmak için, aşağı böylece TCP'lerin çanak yarı yolda jantlar kesme ¾ "bağlayıcı klipleri çip kelepçe (Office Depot) çanak jant üzerinde uyum ve birlikte çanak.
6. PDMS sayfalık bir ayırıcı conta (20'20 mm dış kenarı, 15'15 mm iç kenarı ve 250-500 mm kalınlığında kare şeklinde) (Silikon Özel Ürünler) veya başka herhangi bir silikon Kes ve çanak uygulamak cımbız kullanarak.

BFC ile desenlendirme hücreleri

1. 1 dakika UV ışık altında çanak, conta, BSA ile kaplanmış çip ve 2 bağlayıcı klipleri sterilize edin.
2. BSA aspire ve BFC 200 ml PBS ile iki kez yıkayın.
3. Hücre hattı için gerekli kesme TCP'lerin çanak jelatin ekleyin. Aksi takdirde, yonga (aşağıya bakın) için uygulamadan önce bazı medya TCP'lerin yüzeyi ıslak. Bu odasında oluşan kabarcıkları önler.
4. PBS aspire sonra, hücre çözüm pipet 200 ml (~ 1 × 10 ⁶ hücre / ml) BFC yüzeye. Hücreler 5-10 dakika dinlendiriniz.
5. BFC bir köşesinde bir ~ 15 ° açıyla yatırın ve 200 ml pipet yardımıyla yavaş yavaş hücre çözümü pipetle. Sonra, BFC düz ters BFC köşesine yerleştirin ve 100 mL PBS veya boş medya eklemek. Arası iyi bölgelerden gelen tüm hücreleri temizlemek için, bu şekilde gerekli ek bir 2-4 kez, BFC durulayın.
6. Pipet medya çip yüzeyine 200 ml. TCP'lerin jelatin / medya aspire edin. Sonra, önceden ıslatılmış yemek ters ve yemeğin içine yavaş yavaş, BFC yukarı itin.
7. Odanın iki taraf için bağlayıcı o mühür, her klibin uygulayın. Devrildiğinde bu çanak düzeyde kalır, böylece bağlayıcı klipleri metal çatallar çıkarın.
8. Son olarak, herhangi bir gereksiz hareketi kaçınarak üzerinden kurulum hızlı çevirin, ve inkübatör içine yerleştirin.

Discussion

Burada gösterilen protokol ve video desen fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) BFC ¹ kullanarak tarif olmasına rağmen, BFCs desen ilgi pratikte herhangi bir hücre tipi için kullanılabilir . Biri yapmak gerekebilir tek değişiklik, mikro oyukların boyutunu değiştirmek için. Bizim tecrübelerimize göre en iyi sonucu verir desen tek hücre başka bir hücre tipi, kuyu çapı ve unattached hücre çapı 10 mikrondan daha büyük eşit yükseklikte BFC kullanmak.

BFCs protokolünde önemli değişiklikler olmadan diğer hücreleri de dahil olmak üzere başka yüzeylerde, üzerine desen hücrelere de kullanılıyor olabilir. Mevcut bir hücre tabakasının üzerine Desenlendirme mESCs ve insan EKH dahil olmak üzere bazı celltypes, destek ya da besleyici hücreler kültür uygun fenotipi korumak için gereken yılından bu yana geleneksel hücre desenlendirme yaklaşımlar üzerinde BFC yaklaşımın bir avantajdır.

BFC peşinde olduğu tek bir uygulama fare embriyonik kök hücreleri arasında sinyalizasyon araştırmak için BFC kullanmaktır. Farklı ızgara aralıkları ile kare kafeslerin tek hücre ekim, sinyal molekülleri hücreler tarafından alışverişinde hızını düzenler. Büyük kuyu (40 mikron çaplı) yaparak, aynı zamanda yerel hücre yoğunluğu değiştirerek daha fazla sayıda (~ 2-10) hücreleri belirli bir yerde toplayabilirsiniz. Buna ek olarak, temas hücreleri tarafından yerel hücre yoğunluğu yüksek bir substrat desen, birbirine yakın çok sayıda küçük kuyu yerleştirebilirsiniz. Bu moda, biz bağımsız yayılabilir ve juxtacrine hücreleri arasındaki sinyal modüle. Bir tablo hücreleri olması da birkaç gün içinde hücre izlemek için çok daha kolay hale getirir. Biz BFC hücre desenlendirme kolaylığı diğer araştırmacıların çalışmalarında kullanmak için teşvik edeceğine inanıyoruz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Silicon master mould
Tissue culture dishes	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" binder clips
PBS
hexamethyldisiloxane	Shin-Etsu MicroSi
New Item	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM acetate
Isopropanol
BSA			7.5% Bovine Serum Albumin